發(fā)布時間：2020-06-29 09:37

【摘要】： 吸煙是人類慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要致病因素，香煙中有害成份首先攻擊氣道上皮，氣道上皮的損傷及炎癥是COPD的重要病理特征，氣道上皮的功能缺陷與氣道疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，目前研究證實COPD等氣流受限性疾病發(fā)病過程中，氣道上皮損傷時，炎性細胞活化并浸潤于氣道，使氣道壁感覺神經(jīng)末梢暴露、氣道神經(jīng)及神經(jīng)肽的表型和含量均發(fā)生變化，眾多神經(jīng)肽如P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等大量釋放，它們通過多種形式影響氣道組織并可誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥，表現(xiàn)為氣道腺體分泌增加、血管擴張和血管通透性增加、氣道平滑肌收縮、氣道炎癥細胞活化等。采用單一介質(zhì)拮抗劑所起治療作用往往有限，因此研究調(diào)節(jié)神經(jīng)肽釋放的化學(xué)物質(zhì)可能是阻斷慢性炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要途徑。近年來，神經(jīng)生長因子(NGF)由于具有高效的調(diào)控神經(jīng)肽作用而受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。在多種炎癥性疾病中NGF表達增加，NGF由外周靶細胞(包括免疫炎癥細胞和組織結(jié)構(gòu)細胞如氣道上皮細胞、血管平滑肌細胞、氣道平滑肌細胞、成纖維細胞等)合成并釋放，并可被神經(jīng)軸突末梢攝取，逆行運輸至背根節(jié)，使背根節(jié)感覺神經(jīng)元的敏感性增高，使合成并釋放SP、CGRP等增加。我們的前期研究結(jié)果顯示大鼠腹腔注射NGF后，肺組織中SP的受體即神經(jīng)激肽受體1(NK-1R)表達上調(diào)，提示NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)肽釋放，應(yīng)用抗NGF抗體可減輕RSV感染引起的肺組織神經(jīng)源性炎癥，并使肺組織NK-1R表達下調(diào)。 綜上所述，我們提出假說：COPD存在NGF表達增高；NGF通過上調(diào)SP等神經(jīng)肽調(diào)控COPD氣道神經(jīng)源性炎癥。由此，本實驗測定COPD患者NGF水平，并在已建立的COPD模型中檢測NGF及SP的變化，進一步用抗NGF干預(yù)以觀測COPD大鼠下呼吸道及背根節(jié)SP水平的改變，旨在探討NGF在實驗性COPD大鼠中作用及初步機制，以尋求人類COPD治療的新靶點。為證明上述假設(shè)我們完成了以下研究內(nèi)容。 第一部分：COPD患者血清NGF變化及與肺功能關(guān)系研究 本部分對COPD患者體內(nèi)NGF的變化進行了初步研究，以期進一步探討和揭示人類COPD發(fā)病機制。我們以ELISA法測定COPD急性加重期患者(31例)、穩(wěn)定期患者(30例)及正常對照組24例血清NGF水平，并檢測同期FEV_1／FVC、FEV_1％pre等肺功能指標。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：COPD急性加重期、穩(wěn)定期患者，正常對照者血清NGF蛋白水平分別為30.3±11.7ng／L，17.2±8.5ng／L，7.29±3.4ng／L。與正常對照者相比，COPD急性加重期、穩(wěn)定期患者NGF蛋白水平顯著升高(均為P＜0.05)，且COPD急性加重期患者明顯高于穩(wěn)定期患者(P＜0.05)。無論是COPD急性加重期還是穩(wěn)定期患者血清NGF蛋白水平與FEV_1％pre、FEV_1／FVC％均呈負相關(guān)，在急性加重期分別為rs=-0.73，rs=-0.72(均P＜0.01)，在穩(wěn)定期分別為rs=-0.65，rs=-0.68(均P＜0.05)。 研究結(jié)果提示NGF可能直接參與或調(diào)控COPD炎癥，在患者急性加重期與穩(wěn)定期的整個病程中發(fā)揮作用。 第二部分：COPD模型的建立 首先采用煙熏加氣管內(nèi)注入豬胰彈性蛋白酶的方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病的動物模型。并將Wistar大鼠隨機分為模型組、正常對照組，每組15只。并從肺功能測定、HE染色觀察肺組織病理變化及BALF炎癥細胞計數(shù)等多方面來證實模型的成功性。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組比較：(1)肺功能：COPD模型組大鼠PEF(23.61±2.67 ml／s vs 30.96±2.88 ml／s)、FEV_(0.3)(3.49±0.42ml vs 4.86±0.36 ml)和FEV_(0.3)／FVC((62.25±4.84)％vs (86.68±6.12)％]顯著下降(均P＜0.01)；(2)病理改變：平均內(nèi)襯間隔(136.92±16.71μm vs 36.70±4.48μm)明顯增高，平均肺泡數(shù)(11.07±0.26個／μm~2 vs 24.40±2.83個／μm~2)明顯降低(均P＜0.01)；(3)BALF炎癥細胞：細胞總數(shù)(10~4／ml)(23.93±3.52 VS 15.27±2.40)、中性粒細胞計數(shù)(％)均明顯增高(7.56±1.47 VS 1.80±0.68)(均P＜0.01)。 研究證實煙熏加氣管內(nèi)滴入豬胰彈性蛋白酶的方法可建立穩(wěn)定的大鼠慢性阻塞性肺疾病的動物模型，模型組大鼠有氣道炎癥和肺氣腫改變，小氣道阻力增加，有阻塞性通氣功能障礙。 第三部分：NGF在COPD大鼠中的作用及其機制初探。 為探討NGF在COPD大鼠中的作用及機制，同上方法建立COPD模型和分組：正常對照組、COPD組及抗NGF抗體干預(yù)組，每組15只。模型建立后測定肺功能、BALF炎癥細胞計數(shù)并取肺組織采用HE染色觀察肺組織病理變化，同時采用ELISA法測定COPD大鼠BALF中NGF水平，免疫組化法觀測三組肺組織、背根神經(jīng)節(jié)NGF、SP及肺組織NK-1R變化，原位雜交比較三組背根神經(jīng)節(jié)SP水平，RT-PCR半定量法測定COPD組及正常對照組肺組織、背根神經(jīng)節(jié)NGFmRNA表達，Western-blot法檢測三組NGF蛋白水平變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)COPD模型組與正常對照組比較：；BALF中NGF蛋白水平(ng／L)顯著升高(187.18±64.76 vs 75.13±20.44，P＜0.001)；肺組織及背根神經(jīng)節(jié)NGF蛋白表達無論是免疫組化(平均灰度值104.23±7.74 vs 153.50±8.02，108.95±7.02 vs 171.03±8.14，灰度值越高表明其在細胞中表達的量越低)，還是Western blot(400.4±51.6ng／L vs 198.5±46.2ng／L，318.8±52.6ng／L vs144.2±32.7ng／L)表達均明顯增高(均P＜0.01)；NGF mRNA在肺組織顯著增高(82.07±7.89 vs 51.80±8.34)(P＜0.01)，在背根節(jié)無顯著升高(56.67±6.28 vs 51.87±7.01)(P＞0.05)；NK-1R在肺組織表達顯著升高(平均灰度值101.33±6.31 vs 157.67±8.15)(P＜0.01)；SP在背根節(jié)表達顯著增高(平均灰度值103.40±7.08 vs167.06±7.83)(P＜0.05)；SPmRNA在肺組織無顯著升高(平均灰度值165.53±7.30 vs 168.07±7.05)(P＞0.05)，在背根節(jié)表達顯著增高(平均灰度值103.58±9.63 vs 173.37±12.83)(P＜0.01)。(2)抗NGF組與COPD組相比較：肺組織及背根神經(jīng)節(jié)NGF蛋白表達無論是免疫組化(平均灰度值130.78±6.35 vs 104.23±7.74，135.68±7.13 vs108.95±7.02)，還是Western blot(297.9±43.3ng／L vs 400.4±51.6ng／L，222.3±46.6ng／L vs 318.8±52.6ng／L)表達均明顯降低(均P＜0.01)；NK-1R在肺組織顯著降低(平均灰度值138.20±7.99vs 101.33±6.31)(P＜0.01)；SP在背根節(jié)表達顯著降低(平均灰度值138.00±9.32 vs 103.40±7.08)(P＜0.01)；SPmRNA在背根節(jié)顯著降低(平均灰度值143.21±11.30 vs 103.58±9.63)(P＜0.01)；(3)COPD組大鼠肺組織N6FmRNA與背根節(jié)SPmRNA灰度值表達呈負相關(guān)(rs=-0.81，P＜0.001)。(4)抗NGF組與COPD組比較，BALF細胞總數(shù)(17.13±3.94 vs 23.93±3.52)、中性粒細胞計數(shù)明顯下降(4.65±0.80 vs 7.56±1.47)(P＜0.01)；肺功能PEF(27.88±2.98 vs 23.61±2.67)FEV_(0.3)(3.93±0.25 vs 3.49±0.42)與FEV_(0.3)／FVC(71.48±5.38 vs 62.25±4.84)顯著增高(均P＜0.05)；形態(tài)學(xué)上，平均內(nèi)襯間隔明顯下降(101.88±19.67 vs 136.92±16.71，P＜0.01)。 研究結(jié)果；發(fā)現(xiàn)NGF參與大鼠COPD形成，首次證實NGF干預(yù)能有效抑制COPD大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，改善COPD病理變化及氣流阻塞，其機制可能與下調(diào)氣道感覺神經(jīng)元合成和分泌SP表達有關(guān)。 上述三個部分研究提示NGF通過調(diào)節(jié)氣道感覺神經(jīng)元合成和分泌SP表達參與COPD神經(jīng)源性炎癥，在COPD氣流阻塞中發(fā)揮作用；同時抗NGF干預(yù)可下調(diào)SPmRNA表達和蛋白分泌水平，減輕COPD氣道炎癥。因此我們可以這樣認為：NGF作為氣道神經(jīng)肽SP的上游調(diào)節(jié)因子在COPD氣道神經(jīng)源性炎癥中具有重要調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R563.9
【圖文】：

有多少不等的巨噬細胞(塵細胞)、淋巴細胞和中性粒細胞、少數(shù)嗜酸性細胞等炎癥細胞浸潤，部分管腔纖細狹窄或扭曲擴張，管腔內(nèi)有分泌物存留。血管壁平滑肌增加，血管壁增厚(如圖2一3和圖2一4所示)。絕大多數(shù)區(qū)域細支氣管、呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張，肺泡壁薄厚不均并有不同程度的斷裂，同時融合為肺大泡。COPD組平均內(nèi)襯間隔(MLI)明顯高于正常對照組(只0.01)，平均肺泡數(shù)(MAN)明顯低于正常對照組(只0.01)，見表2一3。表2一3肺組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果(又士s)組別n平均內(nèi)襯間隔(pm)平均肺泡數(shù)(個/。mZ)正常對照組1536.70士4.4824.40士2.83COPD組15 136.92士16.71* 11.07士1.26*注:*與正常對照組相比P<0.ol。尹J’，f一戶.、、，~·、.試‘.1;、.:·_件夕東井、礴‘汀一·;，.。卜戶:‘一一幾-二了圖2一1正常對照組大鼠肺組織(HEx100)圖2一2正常對照組大鼠肺組織 (HExZOO)圖2一 3COPD組大鼠肺組織

有多少不等的巨噬細胞(塵細胞)、淋巴細胞和中性粒細胞、少數(shù)嗜酸性細胞等炎癥細胞浸潤，部分管腔纖細狹窄或扭曲擴張，管腔內(nèi)有分泌物存留。血管壁平滑肌增加，血管壁增厚(如圖2一3和圖2一4所示)。絕大多數(shù)區(qū)域細支氣管、呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張，肺泡壁薄厚不均并有不同程度的斷裂，同時融合為肺大泡。COPD組平均內(nèi)襯間隔(MLI)明顯高于正常對照組(只0.01)，平均肺泡數(shù)(MAN)明顯低于正常對照組(只0.01)，見表2一3。表2一3肺組織形態(tài)學(xué)測量結(jié)果(又士s)組別n平均內(nèi)襯間隔(pm)平均肺泡數(shù)(個/。mZ)正常對照組1536.70士4.4824.40士2.83COPD組15 136.92士16.71* 11.07士1.26*注:*與正常對照組相比P<0.ol。尹J’，f一戶.、、，~·、.試‘.1;、.:·_件夕東井、礴‘汀一·;，.。卜戶:‘一一幾-二了圖2一1正常對照組大鼠肺組織(HEx100)圖2一2正常對照組大鼠肺組織 (HExZOO)圖2一 3COPD組大鼠肺組織

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本文編號：2733718