【摘要】： 目的:“Th1/Th2偏移”假說是哮喘發(fā)病的主要免疫學(xué)機(jī)制,但近年的研究發(fā)現(xiàn)該學(xué)說不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)機(jī)制異常,提出了哮喘是一種對過敏原免疫耐受缺陷的疾患,其中樹突狀細(xì)胞(DCs)可能是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素之一。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建塵螨主要變應(yīng)原基因轉(zhuǎn)染的DCs,研究基因屋塵螨轉(zhuǎn)染DCs誘導(dǎo)哮喘小鼠對致敏抗原的免疫耐受作用和機(jī)制。 研究內(nèi)容: 1、分離小鼠骨髓后體外培養(yǎng)擴(kuò)增DCs。 2、將屋塵螨主要過敏原Der p1、Der p2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DCs,構(gòu)建過敏原轉(zhuǎn)染DCs,觀察過敏原基因轉(zhuǎn)染對DCs表面分子和炎性介質(zhì)分泌的影響; 3、建立屋塵螨提取液致敏/激發(fā)小鼠的肺部變應(yīng)性炎性模型。 4、觀察屋塵螨過敏原轉(zhuǎn)染DCs對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子、肺組織病理變化的影響。 5、觀察清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對屋塵螨轉(zhuǎn)染DCs作用的影響 方法: 1、分離小鼠骨髓細(xì)胞,在含GM-CSF的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞表面分子CD8α、CD11c、MHC II分子。 2、將攜帶有屋塵螨主要過敏原Der p1、Der p2的pDs-Der p1、pCIneo-Der p2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后大量擴(kuò)增抽提質(zhì)粒。以Lipofectamine 2000分別將此二質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DCs后,以流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC II的變化。采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染后DCs分泌IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TGF-β1的變化,采用RT-PCR方法檢測Der p1、Der p2在DCs內(nèi)的表達(dá)。 3、用塵螨提取液經(jīng)腹腔和皮下注射途徑致敏C57BL/6小鼠,14天后滴鼻激發(fā),建立塵螨致敏小鼠肺部變應(yīng)性炎癥模型。 4、分離哮喘小鼠和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞分別加入屋塵螨轉(zhuǎn)染DCs和非轉(zhuǎn)染DCs進(jìn)行共培養(yǎng)后,檢測上清液中IL-4、IL-10、IFN-γ含量的變化,觀察屋塵螨轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R562.25
【圖文】：

圖 3：DCs 細(xì)胞表面分子表達(dá)(單標(biāo)為 CD8α單標(biāo)，雙標(biāo)為 CD11c-MHC II討 論研究中，我們成功地培養(yǎng)了 DCs，且獲得的細(xì)胞是以未成熟 DC 主胞表面表達(dá)豐富的 MHC I、II 類分子及 CD40、CD80、CD86 等多接活化未成熟 CD4+及 CD8+T 淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)的 DC 則很少表達(dá)上述分子，其主要功能是攝取抗原，在攝取抗原器官，同時(shí)自身成熟，然后將所攝取的抗原傳遞至淋巴細(xì)胞。表明，在人和小鼠體內(nèi)存在著不同的 DC 亞型，包括髓系 DCs 和淋巴為髓系DCs在誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)方面比淋巴系DCs的能量的髓系 DCs 可以通過 GM-CSF 刺激而在體外從骨髓祖細(xì)胞中誘研究表明，在培養(yǎng)第 7 天細(xì)胞表面表達(dá) CD11c，而 CD8α陰性，并且低，提示所獲得的 DC 主要是未成熟 DCs，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[56，6

圖 5：瓊脂糖電泳結(jié)果染對 DC 細(xì)胞因子分泌的影響檢測過敏原基因轉(zhuǎn)染對 DCs 作用的影響，我們采用 ELIS Th1、Th2 和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子水平的變化。結(jié)果表明，過(Der p1 組和 Der p2 組)分泌 IL-10(p<0.05)、IL-12(p<0.01)、TIL-4、IFN-γ分泌無顯著變化�？瞻讓φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染 DC(pDsRe、IFN-γ無明顯差異，IL-12、TGF-β1 分泌有所增加(p<0.05原基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞(p<0.05) ，IL-10 與未轉(zhuǎn)染 DCs 相比無顯，IL-10 和 TGF-β1 為調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，均可誘導(dǎo) Tregs 細(xì) Th2 反應(yīng)均有調(diào)節(jié)性作用，TGF-β1 對 Th2 反應(yīng)有抑制作應(yīng)有誘導(dǎo)作用。IL-12 為強(qiáng)力的 Th1 反應(yīng)誘導(dǎo)因子，而 IL

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 祁雪萍;小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：2732169