【摘要】：第一部分消退素D1通過(guò)降低Smad2/3磷酸化水平抑制機(jī)械牽張導(dǎo)致的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化目的:機(jī)械牽張能導(dǎo)致肺纖維化,對(duì)ARDS病人高死亡率有重要影響,消退素D1(Rv D1)具有潛在的促炎癥消退的作用。本研究旨在探討消退素D1在機(jī)械牽張導(dǎo)致的人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)的EMT過(guò)程中可能存在的作用及相關(guān)機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)以人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)為主要研究對(duì)象。牽張前對(duì)體外培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞用40 m M HCl進(jìn)行預(yù)刺激(培養(yǎng)液PH=4.0)10min,對(duì)照組用PBS溶液培養(yǎng)10 min。細(xì)胞處理后,應(yīng)用FX-5000細(xì)胞牽張系統(tǒng),牽張幅度為20%,48h,頻率0.33Hz。實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組(2)HCl組(3)PBS+牽張組(4)HCl+牽張組。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,western blot檢測(cè)E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的變化。應(yīng)用不同濃度的Rv D1和Rv D1的抑制劑BOC-2處理BEAS-2B細(xì)胞,western blot和免疫熒光觀察上述指標(biāo)的變化。接著使用ALK-5抑制劑A8301處理BEAS-2B細(xì)胞后施加20%牽張應(yīng)力48h,western blot觀察Smad2/3和Slug的激活情況,ELISA觀察TGF-β1表達(dá)情況。結(jié)果:1.BEAS-2B細(xì)胞受到HCl預(yù)處理后行20%牽張48h后觀察到細(xì)胞形態(tài)從鵝卵圓形變成長(zhǎng)梭形,細(xì)胞失去極性,細(xì)胞間隙也明顯增寬;與對(duì)照組相比,E-Cadherin蛋白表達(dá)下降,α-SMA、Vimentin表達(dá)升高。2.低濃度的Rv D1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞EMT無(wú)影響,中濃度的Rv D1明顯抑制BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生EMT,高濃度的Rv D1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)變化不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.予以Rv D1的抑制劑BOC-2后,可部分逆轉(zhuǎn)Rv D1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞EMT的作用。4.ALK-5抑制劑A8301處理BEAS-2B細(xì)胞后,Smad2/3和Slug激活受到抑制,TGF-β1表達(dá)水平下調(diào)。結(jié)論:Rv D1處理可通過(guò)抑制Smad2/3磷酸化水平減輕過(guò)度牽張誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞EMT變化。第二部分消退素D1通過(guò)抑制肺上皮細(xì)胞EMT減輕機(jī)械通氣導(dǎo)致的小鼠肺纖維化目的:上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化在肺纖維化過(guò)程中起著重要作用,從在體水平探討消退素D1在抑制機(jī)械通氣相關(guān)肺纖維化中的作用及可能存在的機(jī)制。方法:采用SPF級(jí)別雄性C57小鼠24只,6-8周齡,體重20-23g,隨機(jī)分成4組,每組6只,氣管內(nèi)滴注HCl(p H 1.2,2 ml/kg),同時(shí)用PBS處理作為對(duì)照。24h后行機(jī)械通氣,吸氣峰壓(PIP)22 cm H2O,PEEP 2 cm H2O,呼吸頻率(RR)120次/分,2h。拔管后觀察14天。實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組(2)HCl組(3)通氣組(MV)(4)HCl+通氣(MV)組。HE染色和Masson染色觀察小鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化并判斷肺纖維化程度。檢測(cè)肺組織中Collagen-1、羥脯氨酸的含量變化及肺泡灌洗液中TGF-β1的變化。Western blot檢測(cè)肺組織中E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的變化。隨后觀察不同劑量的Rv D1以及Rv D1的抑制劑BOC-2對(duì)小鼠肺纖維化的影響,western blot和免疫熒光觀察上述指標(biāo)的變化。ALK-5抑制劑A8301處理對(duì)小鼠肺纖維化的影響,western blot觀察Smad2/3和Slug的蛋白變化情況。結(jié)果:1.氣管內(nèi)滴注HCl 24h后行機(jī)械通氣,HE染色和Masson染色顯示與對(duì)照組相比,HCl+MV組中肺組織結(jié)構(gòu)被破壞,肺間隔明顯增厚并出現(xiàn)肺纖維化改變。肺纖維化評(píng)分、肺組織中Collagen-1、羥脯氨酸的含量及肺泡灌洗液中TGF-β1含量明顯增高,上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào),Vimentin表達(dá)明顯上調(diào),α-SMA無(wú)明顯變化。2.不同劑量的Rv D1可以減輕肺纖維化程度,但低劑量和高劑量的Rv D1對(duì)肺組織中羥脯氨酸含量無(wú)明顯降低,E-Cadherin無(wú)明顯表達(dá)上調(diào)。3.予以Rv D1的抑制劑BOC-2后,可部分逆轉(zhuǎn)Rv D1減輕小鼠肺纖維化的作用。4.ALK-5抑制劑A8301處理后肺纖維化程度減輕,Smad2/3和Slug磷酸化水平下調(diào)。結(jié)論:消退素D1通過(guò)抑制肺上皮細(xì)胞EMT減輕機(jī)械通氣導(dǎo)致的小鼠肺纖維化。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R563
【圖文】：

下 BEAS-2B 細(xì)胞受到 20%牽張刺激后細(xì)胞形態(tài)變化。注EAS-2B 受到 48 h 牽張刺激后細(xì)胞形態(tài)變化（×100），激 48 h 后細(xì)胞形態(tài)放大倍數(shù)后改變（×400）。

D 分別代表 BEAS-2B 受到 48 h 牽張刺激后細(xì)胞形態(tài)變化（×100），E、F、G、H 分別代表牽張刺激 48 h 后細(xì)胞形態(tài)放大倍數(shù)后改變（×400）。圖1-2 機(jī)械牽張對(duì)BEAS-2B細(xì)胞EMT的影響。A，B，C，Western blot檢測(cè)E-Cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)情況，D，E，F(xiàn) 是相應(yīng)的灰度值統(tǒng)計(jì)分析圖（n=3）。*p <0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. static+PBS，###p < 0.001 vs. static+HCl。

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本文編號(hào)：2729689