【摘要】： 肺成纖維細(xì)胞膠原分泌增加,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積是肺纖維化(Pulmonary Fibrosis,PF)的主要病理形態(tài)學(xué)改變,其分泌的膠原主要是I型和III型。肺成纖維細(xì)胞膠原分泌增加是肺纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié),減少肺成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)被認(rèn)為是治療肺纖維化的有效方式。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要而復(fù)雜的作用,在各種細(xì)胞因子中,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1 ,TGF-β1)對肺成纖維細(xì)胞膠原分泌的影響作用最大。因此該信號傳導(dǎo)途徑在肺纖維化中的作用成為近年研究熱點。 核因子-κB(Nuclear Factor-κB ,NF-κB)能與多種細(xì)胞因子上游啟動子的特定結(jié)合位點作用,從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的基因表達(dá)。NF-κB對TGF-β1基因表達(dá)的上調(diào)作用已在多個實驗研究中得到證實,鑒于TGF-β在肺纖維化中的重要作用,通過抑制NF-κB的活性,來抑制TGF-β信號傳導(dǎo)途徑對肺成纖維細(xì)胞膠原分泌的上調(diào)作用,從而減少肺成纖維細(xì)胞的膠原分泌,可望成為肺纖維化的有效治療策略。 本研究目的是通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的NF-κB誘捕寡核苷酸策略(decoy-oligonu- -cleotides ,Decoy ODNs)抑制體外肺成纖維細(xì)胞NF-κB的活性,觀察肺成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)量變化情況,為肺纖維化治療探索新的治療途徑。 本課題進(jìn)行了以下兩個方面的研究:1、應(yīng)用肺組織塊法、差時貼壁法原代培養(yǎng)、純化小鼠肺成纖維細(xì)胞,TGF-β5ng/ml刺激后用ODNs-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行干預(yù),采用凝膠電泳阻滯法(Electro- phoretic Mobility Shift Assay,EMSA)檢測不同劑量及不同時間點條件下NF-κB的活性變化;2.通過RT-PCR反應(yīng)檢測NF-κB活性被抑制后肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量。 主要結(jié)果: 1.應(yīng)用肺組織塊法及差時貼壁法相結(jié)合原代培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞,得到高純度肺成纖維細(xì)胞。 2.用EMSA檢測NF-κB活性證實,與對照組比較,decoy ODN-脂質(zhì)體復(fù)合物干預(yù)肺成纖維細(xì)胞后,NF-κB的活性明顯下降(P0.05)。decoy ODN濃度為2μg/ml時, NF-κB活性有所下降,不具統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),濃度為4μg/ml時NF-κB的活性下降(P0.05),但濃度為8μg/ml時NF-κB的活性最低。decoy ODN干預(yù)2小時后即可觀察到NF-κB的活性下降,24小時后NF-κB的活性仍未恢復(fù)。 3.通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT-PCR)反應(yīng)檢測NF-κB活性被抑制后肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量顯示,NF-κB活性被抑制后,Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量均下降(P0.05),其表達(dá)量與NF-κB活性程度呈正相關(guān)。decoy ODN干預(yù)后2小時,Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量下降不明顯,干預(yù)后6小時,膠原mRNA表達(dá)量開始下降,到干預(yù)后24小時,膠原mRNA表達(dá)量仍處于較低水平。 主要結(jié)論: 1.肺組織塊法與差時貼壁法結(jié)合應(yīng)用可有效分離、純化小鼠肺成纖維細(xì)胞。第3～5代細(xì)胞適用于以肺成纖維細(xì)胞為觀察對象的實驗研究。 2.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的NF-κB誘捕寡核苷酸策略能有效抑制NF-κB的活性。相對于2μg/ml及4μg/ml,8μg/ml的decoy ODN濃度對NF-κB活性的抑制作用最好。 3.decoy ODN作用于肺成纖維細(xì)胞早期即發(fā)揮對NF-κB的抑制作用,加入decoy ODN 2小時后NF-κB的活性最低,其對NF-κB的抑制作用至少持續(xù)22小時。decoy ODN對NF-κB活性影響的時效關(guān)系為該方法的進(jìn)一步應(yīng)用提供基本數(shù)據(jù)。 4.抑制NF-κB的活性能有效減少體外肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量,提示抑制NF-κB的活性可減少肺纖維化過程中細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。 5.decoy ODN作用于肺成纖維細(xì)胞6小時即可抑制膠原mRNA表達(dá),抑制作用至少持續(xù)18小時左右。膠原mRNA表達(dá)水平與NF-κB的活性呈正相關(guān),進(jìn)一步證明抑制NF-κB活性的策略可延緩肺纖維化的發(fā)展,可望成為肺纖維化的有效治療方法之一。其實際應(yīng)用中的價值尚需進(jìn)一步研究確定。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R563.9
【圖文】：

資料用 x ±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因5表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)天以內(nèi)的昆明小鼠肺組織經(jīng)分離、純化后可獲得08, 純度高達(dá)(94±1) % , 臺盼藍(lán)拒染實驗檢測接顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長梭形, 細(xì)胞亮,30 min 左入對數(shù)生長期, 分離純化后3 d 接近融合, 并彼觀察，細(xì)胞呈梭形，多突起，胞漿紅染，胞核藍(lán)點，如圖3。

原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞 （倒置顯微鏡，×50）：傳代三織樣細(xì)胞 lung fibroblast of Balb/c mice(×50）: after 3th transfer of tive tissue cells left.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 申衛(wèi)紅;彭鑫;茹松偉;宗揚勇;邵啟祥;;核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路的激活與阻斷[J];生命的化學(xué);2007年03期

本文編號：2723376