【摘要】：第一部分:紅霉素對(duì)慢性阻塞性肺疾病外周血單個(gè)核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗的研究目的:探討COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)糖皮質(zhì)激素抵抗情況以及紅霉素干預(yù)對(duì)其的影響方法:選取健康人、吸煙的健康人、穩(wěn)定期的COPD患者各8例,分組:(1)正常對(duì)照組(2)吸煙組(3)COPD組(4)COPD+紅霉素組,每個(gè)研究對(duì)象抽取外周靜脈血20ml,在無菌條件下采用泛影鈉-不連續(xù)密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)。應(yīng)用ELISA測(cè)定IL-8:COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,再與不同濃度的地塞米松(Dex,10~(-12)-10~(-6)M)共孵育2h后,應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α,5ng/ml)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA測(cè)量IL-8的表達(dá),得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計(jì)算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex),IC50-Dex越高說明細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感性越差,糖皮質(zhì)激素抵抗也就越高。結(jié)果:1.健康人與吸煙的健康人的PBMCs的IC50-Dex無明顯差異。2.COPD患者IL-8的抑制率顯著降低,IC50-Dex顯著增高(P0.05),予以紅霉素干預(yù),COPD患者外周血PBMCs IL-8抑制率增高,IC50-Dex顯著降低,但仍低于健康人。結(jié)論:1.與健康人和吸煙的健康人相比,COPD患者PBMCs存在明顯的糖皮質(zhì)激素抵抗。2.紅霉素可以減輕COPD患者PBMC糖皮質(zhì)激素抵抗。第二部分:紅霉素對(duì)煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗和轉(zhuǎn)錄因子AP-1的影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:1.探討煙草煙霧暴露下U937單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗情況以及紅霉素干預(yù)對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗的影響。2.探討紅霉素對(duì)煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞AP-1表達(dá)的影響。方法:本部分采用U937單核細(xì)胞為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)分組:(1)正常對(duì)照組(2)煙草提取物(CSE)組(3)CSE+紅霉素組。1.ELISA法測(cè)定IL-8:CSE+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h后,CSE組與CSE+紅霉素組予0.25%CSE共孵育刺激2h,再與不同濃度的地塞米松(Dex,10-12-10-6M)共孵育2h后,應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA測(cè)量IL-8的表達(dá),得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計(jì)算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex),分析每組的糖皮質(zhì)激素抵抗情況。2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)測(cè)定C-JUN和C-FOS mRNA的表達(dá):COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,然后CSE組及CSE+紅霉素組加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集細(xì)胞提取RNA測(cè)定mRNA,分析每組C-JUN和C-FOS mRNA的表達(dá)。3.Western Blotting測(cè)定C-JUN和C-FOS蛋白的表達(dá):COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,然后CSE組及CSE+紅霉素組加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集細(xì)胞提取胞內(nèi)核蛋白,采用Western Blotting測(cè)定C-JUN和C-FOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.單核細(xì)胞暴露于煙草煙霧后,IL-8抑制率顯著降低,IC50-Dex顯著增高(P0.05),給予紅霉素預(yù)孵育后,IC50-Dex顯著降低,糖皮質(zhì)激素抵抗減輕。2.單核細(xì)胞暴露于煙草煙霧后,C-FOS mRNA和C-JUN mRNA和表達(dá)明顯增高,紅霉素預(yù)孵育干預(yù)后可以降低C-FOS mRNA和C-JUNmRNA的表達(dá)。3.煙草煙霧刺激單核細(xì)胞后,C-FOS蛋白表達(dá)無改變,而C-JUN蛋白水平表達(dá)顯著增高。同時(shí)紅霉素干預(yù)對(duì)C-FOS的表達(dá)無影響,但可以顯著降低C-JUN蛋白表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.CSE刺激單核細(xì)胞導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗,紅霉素可以減輕煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗。2.CSE刺激單核細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄因子C-FOS mRNA表達(dá)增高,但蛋白水平表達(dá)無改變,且紅霉素對(duì)C-FOS蛋白表達(dá)無影響。3.CSE刺激單核細(xì)胞后,C-JUN的蛋白和mRNA表達(dá)增高,紅霉素干預(yù)可以減少C-JUN蛋白和mRNA的表達(dá)。第三部分:紅霉素通過下調(diào)JNK/C-JUN路徑而減輕煙草煙霧暴露下引發(fā)的單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗目的:1.探討C-JUN在煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗的作用。2.探討紅霉素減輕煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗具體作用路徑。方法:1.觀察煙草煙霧暴露下U937單核細(xì)胞C-JUN的表達(dá)對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗的影響,采用SiRNA C-JUN轉(zhuǎn)染技術(shù)降低C-JUN在U937單核細(xì)胞中的表達(dá),將細(xì)胞分為四組:(1)正常對(duì)照組(2)煙草提取物(CSE)組(3)SiRNA C-JUN組。(4)CSE+SiRNA C-JUN組。2.觀察紅霉素對(duì)C-JUN上游路徑MAPK的影響,將U937細(xì)胞分六組:(1)正常對(duì)照組(2)CSE組(3)CSE+紅霉素組。(4)CSE+JNK抑制劑組(5)CSE+P38MAPK抑制劑組(6)CSE+ERK抑制劑組。采用ELISA法測(cè)定IL-8的表達(dá),得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計(jì)算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex)。RT-PCR測(cè)定各組C-JUN、P38MAPK、ERK、JNK mRNA在U937單核細(xì)胞中的表達(dá)。Western Blotting測(cè)定各組C-JUN、P38MAPK、P-P38MAPK、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK蛋白表達(dá)。分析各組之間的差異。結(jié)果:1.SiRNA干擾C-JUN的表達(dá)后,U937單核細(xì)胞暴露于CSE下IL-8表達(dá)降低,且IC50-Dex顯著降低,糖皮質(zhì)激素敏感性明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.與CSE組比較,U937細(xì)胞予以紅霉素、JNK抑制劑、P38MAPK抑制劑、ERK抑制劑預(yù)孵育2h后再予以CSE刺激,C-JUN mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.與CSE組相比,紅霉素組、JNK抑制劑、P38MAPK抑制劑、ERK抑制劑干預(yù)降低IC50-Dex明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.紅霉素對(duì)P38MAPK、P-P38MAPK及ERK、P-ERK蛋白表達(dá)無影響,但紅霉素可以顯著減少JNK和P-JNK蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.SiRNA干擾C-JUN的表達(dá)后,香煙煙霧暴露刺激單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗程度減輕,C-JUN的表達(dá)增高在糖皮質(zhì)激素抵抗起重要作用。2.抑制JNK、P38MAPK、ERK活性可以減少暴露于煙草煙霧下單核細(xì)胞C-JUNmRNA和蛋白的表達(dá)及減輕糖皮質(zhì)激素抵抗。3.紅霉素可以抑制JNK的表達(dá)和活性,推測(cè)紅霉素是通過抑制JNK的活性而減輕C-JUN的表達(dá),從而減輕糖皮質(zhì)激素抵抗。
【圖文】：

通過 Microsoft Excel 2003 計(jì)算出各組 IL-8 的抑地塞米松在 10-6-10-10mmol/L 的濃度的時(shí)，，正常人的抑10-7：73.1±4.2%，10-8：67.5±3.5%，10-9：62.1±4.25健康吸煙者的抑制率（10-6：73.9±3.2%，10-7：72.0±210-9：64.4±3.52%，10-10：49.9±3.0%），COPD 的抑制10-7：52.1±3.5%，10-8：50.1±3.7%，10-9：43.3±3.8%予以紅霉素干預(yù)后的抑制率（10-6：66.1±4.7%，1062.1±4.5%；10-9：58.4±3.6%，10-10：39.4±3.2%）。算各組的 IC50-Dex，COPD 組為 4.34±0.32×10-8mmo和吸煙健康人（分別為 5.27±0.19×10-10mmol/ml、5.P＜0.05。COPD 患者外周血 PBMCs 給予紅霉素干預(yù)感性恢復(fù)。IC50-Dex 為 2.62±0.15×10-9mmol/ml，P＜

露于 CSE 下的單核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素抵抗的影響：icrosoft Excel 2003 計(jì)算出 IL-8 的抑制率，如圖 2-1 所示10-10的濃度的時(shí)候，對(duì)照組的抑制率（10-6：64.1±3.8%10-8：56.6±3.1%，10-9：47.5±4.7%，10-10：28.4±3.6%（10-6：48.6±2.6%，10-7：45.6±2.1%，10-8：43.2±2.7%10-10：18.3±3.0%），CSE+EM 組的抑制率（10-6：59.1±.9%，10-8：50.1±2.5%，10-9：43.5±1.8%，10-10：32.5±ft Excel 2003 計(jì) 算 各 組 的 IC50-Dex ， CSE0-7mmol/ml，明顯高于對(duì)照組 8.47±0.19×10-9mmol/ml，P預(yù)孵育后，可以恢復(fù) U937 單核細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素敏 2.13±0.15×10-8mmol/ml，P＜0.05。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 老啟芳;曾小良;鐘小寧;張建全;何志義;;肺功能正常吸煙者和慢性阻塞性肺疾病患者肺動(dòng)脈炎癥和小氣道炎癥的相關(guān)性研究[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2014年12期

2 劉積鋒;鐘小寧;何志義;鐘德鈞;白晶;張建全;鐘蔚;;小劑量羅紅霉素對(duì)支氣管擴(kuò)張癥穩(wěn)定期治療的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2012年11期

3 老啟芳;鐘小寧;何志義;柳廣南;呂自力;萬鵬;;肺功能正常吸煙者和慢性阻塞性肺疾病患者肺腺泡動(dòng)脈炎癥特征[J];中華內(nèi)科雜志;2011年10期

本文編號(hào)：2711393