【摘要】：第一部分:紅霉素對慢性阻塞性肺疾病外周血單個核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗的研究目的:探討COPD患者外周血單個核細胞(PBMCs)糖皮質(zhì)激素抵抗情況以及紅霉素干預(yù)對其的影響方法:選取健康人、吸煙的健康人、穩(wěn)定期的COPD患者各8例,分組:(1)正常對照組(2)吸煙組(3)COPD組(4)COPD+紅霉素組,每個研究對象抽取外周靜脈血20ml,在無菌條件下采用泛影鈉-不連續(xù)密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞體外培養(yǎng)。應(yīng)用ELISA測定IL-8:COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,再與不同濃度的地塞米松(Dex,10~(-12)-10~(-6)M)共孵育2h后,應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α,5ng/ml)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA測量IL-8的表達,得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex),IC50-Dex越高說明細胞對糖皮質(zhì)激素敏感性越差,糖皮質(zhì)激素抵抗也就越高。結(jié)果:1.健康人與吸煙的健康人的PBMCs的IC50-Dex無明顯差異。2.COPD患者IL-8的抑制率顯著降低,IC50-Dex顯著增高(P0.05),予以紅霉素干預(yù),COPD患者外周血PBMCs IL-8抑制率增高,IC50-Dex顯著降低,但仍低于健康人。結(jié)論:1.與健康人和吸煙的健康人相比,COPD患者PBMCs存在明顯的糖皮質(zhì)激素抵抗。2.紅霉素可以減輕COPD患者PBMC糖皮質(zhì)激素抵抗。第二部分:紅霉素對煙草煙霧暴露下單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗和轉(zhuǎn)錄因子AP-1的影響的實驗研究目的:1.探討煙草煙霧暴露下U937單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗情況以及紅霉素干預(yù)對糖皮質(zhì)激素抵抗的影響。2.探討紅霉素對煙草煙霧暴露下單核細胞AP-1表達的影響。方法:本部分采用U937單核細胞為研究對象,實驗分組:(1)正常對照組(2)煙草提取物(CSE)組(3)CSE+紅霉素組。1.ELISA法測定IL-8:CSE+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h后,CSE組與CSE+紅霉素組予0.25%CSE共孵育刺激2h,再與不同濃度的地塞米松(Dex,10-12-10-6M)共孵育2h后,應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激16h后,收集上清液,采用ELISA測量IL-8的表達,得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex),分析每組的糖皮質(zhì)激素抵抗情況。2.應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定C-JUN和C-FOS mRNA的表達:COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,然后CSE組及CSE+紅霉素組加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集細胞提取RNA測定mRNA,分析每組C-JUN和C-FOS mRNA的表達。3.Western Blotting測定C-JUN和C-FOS蛋白的表達:COPD+紅霉素組先予以紅霉素10μg/ml濃度預(yù)孵育2h,然后CSE組及CSE+紅霉素組加入0.25%的CSE共孵育8h后,收集細胞提取胞內(nèi)核蛋白,采用Western Blotting測定C-JUN和C-FOS蛋白的表達。結(jié)果:1.單核細胞暴露于煙草煙霧后,IL-8抑制率顯著降低,IC50-Dex顯著增高(P0.05),給予紅霉素預(yù)孵育后,IC50-Dex顯著降低,糖皮質(zhì)激素抵抗減輕。2.單核細胞暴露于煙草煙霧后,C-FOS mRNA和C-JUN mRNA和表達明顯增高,紅霉素預(yù)孵育干預(yù)后可以降低C-FOS mRNA和C-JUNmRNA的表達。3.煙草煙霧刺激單核細胞后,C-FOS蛋白表達無改變,而C-JUN蛋白水平表達顯著增高。同時紅霉素干預(yù)對C-FOS的表達無影響,但可以顯著降低C-JUN蛋白表達(P0.05)。結(jié)論:1.CSE刺激單核細胞導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗,紅霉素可以減輕煙草煙霧暴露下單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗。2.CSE刺激單核細胞后轉(zhuǎn)錄因子C-FOS mRNA表達增高,但蛋白水平表達無改變,且紅霉素對C-FOS蛋白表達無影響。3.CSE刺激單核細胞后,C-JUN的蛋白和mRNA表達增高,紅霉素干預(yù)可以減少C-JUN蛋白和mRNA的表達。第三部分:紅霉素通過下調(diào)JNK/C-JUN路徑而減輕煙草煙霧暴露下引發(fā)的單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗目的:1.探討C-JUN在煙草煙霧暴露下單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗的作用。2.探討紅霉素減輕煙草煙霧暴露下單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗具體作用路徑。方法:1.觀察煙草煙霧暴露下U937單核細胞C-JUN的表達對糖皮質(zhì)激素抵抗的影響,采用SiRNA C-JUN轉(zhuǎn)染技術(shù)降低C-JUN在U937單核細胞中的表達,將細胞分為四組:(1)正常對照組(2)煙草提取物(CSE)組(3)SiRNA C-JUN組。(4)CSE+SiRNA C-JUN組。2.觀察紅霉素對C-JUN上游路徑MAPK的影響,將U937細胞分六組:(1)正常對照組(2)CSE組(3)CSE+紅霉素組。(4)CSE+JNK抑制劑組(5)CSE+P38MAPK抑制劑組(6)CSE+ERK抑制劑組。采用ELISA法測定IL-8的表達,得出濃度-抑制反應(yīng)曲線并計算出各組地塞米松半數(shù)抑制濃度(IC50-Dex)。RT-PCR測定各組C-JUN、P38MAPK、ERK、JNK mRNA在U937單核細胞中的表達。Western Blotting測定各組C-JUN、P38MAPK、P-P38MAPK、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK蛋白表達。分析各組之間的差異。結(jié)果:1.SiRNA干擾C-JUN的表達后,U937單核細胞暴露于CSE下IL-8表達降低,且IC50-Dex顯著降低,糖皮質(zhì)激素敏感性明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.與CSE組比較,U937細胞予以紅霉素、JNK抑制劑、P38MAPK抑制劑、ERK抑制劑預(yù)孵育2h后再予以CSE刺激,C-JUN mRNA和蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.與CSE組相比,紅霉素組、JNK抑制劑、P38MAPK抑制劑、ERK抑制劑干預(yù)降低IC50-Dex明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.紅霉素對P38MAPK、P-P38MAPK及ERK、P-ERK蛋白表達無影響,但紅霉素可以顯著減少JNK和P-JNK蛋白的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.SiRNA干擾C-JUN的表達后,香煙煙霧暴露刺激單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗程度減輕,C-JUN的表達增高在糖皮質(zhì)激素抵抗起重要作用。2.抑制JNK、P38MAPK、ERK活性可以減少暴露于煙草煙霧下單核細胞C-JUNmRNA和蛋白的表達及減輕糖皮質(zhì)激素抵抗。3.紅霉素可以抑制JNK的表達和活性,推測紅霉素是通過抑制JNK的活性而減輕C-JUN的表達,從而減輕糖皮質(zhì)激素抵抗。
【圖文】：

通過 Microsoft Excel 2003 計算出各組 IL-8 的抑地塞米松在 10-6-10-10mmol/L 的濃度的時，，正常人的抑10-7：73.1±4.2%，10-8：67.5±3.5%，10-9：62.1±4.25健康吸煙者的抑制率（10-6：73.9±3.2%，10-7：72.0±210-9：64.4±3.52%，10-10：49.9±3.0%），COPD 的抑制10-7：52.1±3.5%，10-8：50.1±3.7%，10-9：43.3±3.8%予以紅霉素干預(yù)后的抑制率（10-6：66.1±4.7%，1062.1±4.5%；10-9：58.4±3.6%，10-10：39.4±3.2%）。算各組的 IC50-Dex，COPD 組為 4.34±0.32×10-8mmo和吸煙健康人（分別為 5.27±0.19×10-10mmol/ml、5.P＜0.05。COPD 患者外周血 PBMCs 給予紅霉素干預(yù)感性恢復(fù)。IC50-Dex 為 2.62±0.15×10-9mmol/ml，P＜

露于 CSE 下的單核細胞糖皮質(zhì)激素抵抗的影響：icrosoft Excel 2003 計算出 IL-8 的抑制率，如圖 2-1 所示10-10的濃度的時候，對照組的抑制率（10-6：64.1±3.8%10-8：56.6±3.1%，10-9：47.5±4.7%，10-10：28.4±3.6%（10-6：48.6±2.6%，10-7：45.6±2.1%，10-8：43.2±2.7%10-10：18.3±3.0%），CSE+EM 組的抑制率（10-6：59.1±.9%，10-8：50.1±2.5%，10-9：43.5±1.8%，10-10：32.5±ft Excel 2003 計 算 各 組 的 IC50-Dex ， CSE0-7mmol/ml，明顯高于對照組 8.47±0.19×10-9mmol/ml，P預(yù)孵育后，可以恢復(fù) U937 單核細胞的糖皮質(zhì)激素敏 2.13±0.15×10-8mmol/ml，P＜0.05。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563.9

【參考文獻】

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1 老啟芳;曾小良;鐘小寧;張建全;何志義;;肺功能正常吸煙者和慢性阻塞性肺疾病患者肺動脈炎癥和小氣道炎癥的相關(guān)性研究[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2014年12期

2 劉積鋒;鐘小寧;何志義;鐘德鈞;白晶;張建全;鐘蔚;;小劑量羅紅霉素對支氣管擴張癥穩(wěn)定期治療的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2012年11期

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本文編號：2711393