【摘要】： 第一部分原代大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定 背景 肺泡上皮易受各種應(yīng)激的損傷,它的損傷后修復(fù)主要依賴于肺泡上皮的干細(xì)胞——肺泡II型上皮細(xì)胞(alveolar type II epithelial cells,ATII cells)。ATII細(xì)胞體積較小、呈立方形,占肺泡上皮細(xì)胞數(shù)的60%左右,能通過增殖、鋪展、遷移,并最終轉(zhuǎn)化為肺泡I型上皮細(xì)胞(alveolar type I epithelial cells, ATI cells),恢復(fù)肺泡上皮正常的形態(tài)和功能。另外,ATII細(xì)胞還具有很多重要功能:合成、分泌和重新利用表面活性物質(zhì);轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水分;合成免疫效應(yīng)分子。但ATII細(xì)胞的原代分離、純化技術(shù)較為復(fù)雜,本研究的目的是掌握成年大鼠ATII細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)技術(shù),以獲得數(shù)量足夠、純度高的ATII細(xì)胞,滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要。 目的 確定成年大鼠原代ATⅡ細(xì)胞分離1、純化、培養(yǎng)的技術(shù)方法,為研究氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞存活、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供數(shù)量足夠和高純度的ATⅡ細(xì)胞,以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。 方法 水合氯醛麻醉清潔級Spraque-Dawley大鼠(約200 g),打開胸腔行肺動脈插管,以生理鹽水沖凈肺血。整體取出心肺和氣管,氣管插管,以緩沖液灌洗肺泡腔10次。將0.08%胰蛋白酶消化液從氣管注入肺泡,置于37°C,5%二氧化碳(carbon dioxide, CO2)培養(yǎng)箱,每隔5分鐘添加適量消化液, 20分鐘后,去除氣管及肺門周圍結(jié)締組織置于250μg/ml脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)和終止血清混合液中,快速剪肺至1 mm3小塊,篩網(wǎng)過濾,離心收集細(xì)胞, DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中,吸附純化2 h,用含10%胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于6孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板,細(xì)胞接種后24h換液,繼續(xù)培養(yǎng)12h備用。臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力。透射電鏡(Transmitting electron microscopy, TEM)鑒定細(xì)胞,改良巴式染色法確定細(xì)胞純度。在體外培養(yǎng)細(xì)胞不同的時間(36、72、96和120 h)觀察細(xì)胞的性狀和形態(tài)變化。 結(jié)果 1.細(xì)胞的產(chǎn)量約為2×107個/只大鼠。 2.電鏡下觀察到ATⅡ細(xì)胞典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)——板層小體;改良巴式染色法證實(shí)細(xì)胞純度 90%。 3.臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力 90%。 4.體外培養(yǎng)36至72 h時細(xì)胞生長良好,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多顆粒;96 h以后細(xì)胞呈長索形,細(xì)胞內(nèi)顆粒減少,并出現(xiàn)空泡。 結(jié)論 利用0.08%胰酶消化分離和大鼠Ig免疫粘附純化,可獲得高產(chǎn)量、高純度、高活力的原代ATⅡ細(xì)胞,能滿足實(shí)驗(yàn)的需要。ATⅡ細(xì)胞體外培養(yǎng)36至72 h時生長良好,可進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。 第二部分氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡II型上皮細(xì)胞的損傷作用及JNK調(diào)控作用 背景 氧氣療法是臨床上治療急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但長時間高氧暴露可引起氧化應(yīng)激性肺損傷。高濃度氧氣(氧氣體積分?jǐn)?shù) 0.95,簡稱高氧)暴露下產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素。ROS可造成細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化損傷,蛋白質(zhì)的應(yīng)激性修飾,基因的畸變等細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞完整性和功能的破壞。更為重要的是ROS還可通過激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號系統(tǒng)而參與細(xì)胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases, MAPKs)家族信號通路是多種刺激通過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和p38三條信號通路組成,其中JNK信號通路是一條主要的應(yīng)激信號通路,在調(diào)控細(xì)胞的生長、凋亡和免疫反應(yīng)等方面具有重要作用,但JNK信號的作用因細(xì)胞種類、刺激類型而有所差異。氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞的凋亡(在肺損傷和纖維化中具有重要作用)可能涉及JNK信號,但JNK信號在其中起的作用尚不清除。 目的 1.采用過氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)和無血清培養(yǎng)基建立原代大鼠ATII細(xì)胞的氧化損傷模型。 2.研究H2O2對ATII細(xì)胞形態(tài)、存活和凋亡的影響,探討細(xì)胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應(yīng)關(guān)系。 3.了解氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞凋亡過程中JNK的活化情況,并采用JNK信號抑制劑預(yù)先干預(yù),觀察其是否能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的JNK的活化,從而研究JNK對細(xì)胞凋亡的作用。 方法 分離、純化清潔級Spraque-Dawley成年大鼠的ATⅡ細(xì)胞,臺盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性,改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度。ATⅡ細(xì)胞用不同濃度的H2O2(0μM、50μM、100μM、500μM和1000μM)處理3 h;以500μM H2O2處理不同時間(0 h、1 h、3 h、6 h和9 h);采用倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)變化,MTT比色法測定細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)定量檢測凋亡率,以明確細(xì)胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應(yīng)關(guān)系。500μM H2O2作用細(xì)胞3h后,透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡改變。western blot檢測500μM H2O2刺激ATⅡ細(xì)胞(0、5、10、30、60、180、360和540 min)后p-JNK的表達(dá)。在研究JNK信號作用時,細(xì)胞隨機(jī)分為4組:以無血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞3h,設(shè)為對照組(CON組);25μM SP600125(JNK信號特異性抑制劑)預(yù)處理,再以無血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞3 h,設(shè)為CON+SP組;以500μM H2O2作用細(xì)胞3h,設(shè)為H2O2組;細(xì)胞預(yù)先加入25μM SP600125(JNK信號特異性抑制劑),再以500μM H2O2刺激3 h,設(shè)為H2O2+SP組,檢測細(xì)胞的存活率和凋亡率;熒光顯微鏡觀察熒光染料4,6-二咪基-4-聯(lián)苯基吲哚(4',6-Diamidino -2- phenylindole, DAPI)染色后細(xì)胞核的形態(tài)變化。 結(jié)果 1.不同濃度H2O2刺激ATⅡ細(xì)胞3 h后,與對照組(0μM H2O2)比較,10μM H2O2處理組的細(xì)胞生長形態(tài)無明顯差異;100μM H2O2處理組細(xì)胞間隙稍增寬; 500μM H2O2處理組,細(xì)胞間隙增寬,體積略減小,部分細(xì)胞核濃縮變小,細(xì)胞內(nèi)顆粒(板層小體)減少,1000μM H2O2處理時,大量細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,變圓,可見細(xì)胞脫壁。在500μM H2O2作用細(xì)胞不同時間時,與對照組(0 h H2O2)比較,同樣發(fā)現(xiàn)隨處理時間的延長,細(xì)胞的形態(tài)損害隨之加重。 2.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)500μM H2O2處理3 h后,部分細(xì)胞發(fā)生典型凋亡改變:細(xì)胞體積減小,胞質(zhì)濃縮,胞膜內(nèi)陷,多個凋亡小體圍繞,小體內(nèi)可見明顯胞核物質(zhì)。 3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對照組(0μM H2O2)相比,50μM、100μM H2O2處理對ATⅡ細(xì)胞存活率無明顯影響(P 0.05),500μM和1000μM H2O2處理后, ATⅡ細(xì)胞存活率呈下降明顯(P 0.05)。500μM H2O2處理不同時間后,與對照組(0 h H2O2)比較,隨作用時間的延長,細(xì)胞存活率逐漸下降,與對照組相比有顯著差異(P 0.05)。 4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與對照組(0 h H2O2)比較, 500μM H2O2處理ATⅡ細(xì)胞不同時間后,隨H2O2作用時間的延長, ATⅡ細(xì)胞凋亡率呈明顯上升趨勢(P 0.05)。 5.500μM H2O2刺激后能很快激活JNK,p-JNK的表達(dá)在刺激30 min時表達(dá)最強(qiáng),隨后其表達(dá)逐漸減弱,SP600125預(yù)處理能有效抑制H2O2誘導(dǎo)JNK的活化。 6.與H2O2組(500μM H2O2作用細(xì)胞3h組)比較,H2O2+SP組(SP600125預(yù)處理,再以500μM H2O2作用細(xì)胞3h組)細(xì)胞存活率上升而凋亡率下降(P均 0.05)。 7.熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)DAPI染色后正常對照組ATⅡ細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)完整,發(fā)出淺藍(lán)色熒光,H2O2組細(xì)胞多數(shù)細(xì)胞核濃集、固縮,發(fā)出明亮藍(lán)色熒光,而H2O2+SP組細(xì)胞核的損傷較H2O2組減輕。 結(jié)論 1. H2O2以濃度和時間依賴的方式誘導(dǎo)ATⅡ細(xì)胞損傷。 2.通過流式細(xì)胞儀和電鏡證實(shí):H2O2刺激可誘導(dǎo)ATⅡ細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3. JNK參與了氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并對ATⅡ細(xì)胞起促凋亡的作用。 第三部分JNK對ATII細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活化的調(diào)控作用 背景 目前廣泛認(rèn)為在高氧暴露過程中產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素,ROS刺激可引起肺組織細(xì)胞的凋亡。近年來,ROS對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用逐漸引起人們的重視。ATⅡ細(xì)胞對維持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用,如果它過度凋亡,肺損傷和組織纖維化將不可避免。越來越多的研究者關(guān)注ATⅡ細(xì)胞的凋亡,但是氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。第二部分證實(shí)了JNK信號通路參與了氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并對ATⅡ細(xì)胞起促凋亡的作用,但JNK究竟通過哪些途徑達(dá)到促細(xì)胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分進(jìn)一步研究ROS對肺泡上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響,并探索JNK信號對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 目的 1.觀察ROS對ATⅡ細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial transmembrane potential, MMP)的損傷作用。 2.研究ROS對肺泡上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 3.使用JNK信號抑制劑SP600125,探索JNK信號對氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 方法 Western blot法檢測500μM H2O2刺激前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的表達(dá),并采用SP600125阻斷JNK信號活化后,研究JNK信號對以上蛋白表達(dá)或活化的影響。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測熒光染料JC-1染色后線粒體膜電位的變化。Mitotracker Red標(biāo)記ATⅡ細(xì)胞線粒體,免疫熒光技術(shù)檢測p53和NF-κB p65,激光共聚焦顯微鏡觀察H2O2刺激前后p53和NF-κB的表達(dá)和分布情況。 結(jié)果 1. JC-1染色后,熒光顯微鏡下觀察JC-1多聚體(紅色熒光)和單體(綠色熒光)的變化情況,發(fā)現(xiàn)正常對照組細(xì)胞發(fā)出鮮艷的紅色熒光,無綠色熒光,500μM H2O2刺激后,紅色熒光逐漸暗淡,綠色熒光逐漸增強(qiáng);流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)500μM H2O2刺激后,隨作用時間的延長,紅/綠熒光強(qiáng)度比值逐漸下降。 2. Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與正常對照組比較,500μM H2O2刺激后,隨作用時間的延長,Bax、p53、active caspase-3和NF-κB p65的表達(dá)逐漸增加;SP600125預(yù)處理可明顯降低H2O2刺激后以上相關(guān)蛋白的表達(dá)。 3.激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組ATⅡ細(xì)胞p53和NF-κB p65的表達(dá)十分微弱,H2O2刺激后,p53和NF-κB p65的表達(dá)明顯增加,并且它們都主要分布在細(xì)胞核內(nèi);SP600125預(yù)處理可明顯降低H2O2刺激后p53和NF-κB p65的核內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)論 1. H2O2刺激能破壞ATⅡ細(xì)胞線粒體膜電位,隨刺激時間的延長,線粒體膜電位明顯下降。 2. H2O2刺激能通過JNK信號通路,明顯上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的表達(dá)與活化,從而起到促細(xì)胞凋亡作用。 第四部分NAC對氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺泡II型上皮細(xì)胞的調(diào)控作用 背景 既然氧化應(yīng)激下ROS對細(xì)胞的死亡起著關(guān)鍵作用,我們認(rèn)為抗氧化處理可能有助于抑制氧化應(yīng)激下ATΙΙ細(xì)胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)可作為還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione, GSH)合成的前體,在氧化應(yīng)激下多種細(xì)胞的研究中已顯示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC處理能否對氧化應(yīng)激下ATΙΙ細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究探討NAC對氧化應(yīng)激下MAPKs激活的影響和ATΙΙ細(xì)胞的保護(hù)作用。 目的 1.研究NAC預(yù)處理能否對氧化應(yīng)激下的ATⅡ細(xì)胞起保護(hù)作用。 2.研究NAC預(yù)處理對H2O2刺激后ATⅡ細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MAPKs激活的影響。 方法 原代培養(yǎng)的大鼠ATⅡ細(xì)胞,隨機(jī)分為4組:正常對照組(CON組)、CON+NAC組、H2O2組和H2O2+NAC組。MTT法檢測各組細(xì)胞存活率的變化,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平。Western blot檢測H2O2刺激及NAC干預(yù)后p-JNK、p-ERK和p-p38的表達(dá)的變化。 結(jié)果 1.與正常對照組比較, H2O2組細(xì)胞存活率明顯下降(P 0.05),細(xì)胞凋亡率明顯上升(P 0.05)。 2.與正常對照組比較, H2O2組ATⅡ細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升(P 0.05); H2O2刺激后p-JNK、p-ERK和p-p38的表達(dá)也明顯增加(P0.05)。 3.與H2O2組比較,H2O2+NAC組細(xì)胞存活率明顯升高(P 0.05),凋亡率明顯下降(P 0.05)。 4.與H2O2組比較,H2O2+NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降(P 0.05),NAC預(yù)處理能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的p-JNK、p-ERK和p-p38表達(dá)。 結(jié)論 氧化應(yīng)激能激活包括JNK信號在內(nèi)的MAPKs信號系統(tǒng),上調(diào)ATⅡ細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,并誘導(dǎo)ATⅡ細(xì)胞凋亡;NAC通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS和抑制包括JNK在內(nèi)的MAPKs的活化,減輕氧化應(yīng)激下ATⅡ細(xì)胞的凋亡而對ATⅡ細(xì)胞起保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 臺盼藍(lán)染色(×100)Fig 1 Trypan blue staining of ATⅡ cells(×100) 改良巴氏染色鑒定細(xì)胞：ATⅡ細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中含有豐富的深藍(lán)

改良巴氏染色鑒定細(xì)胞：ATⅡ細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中含有豐富的深藍(lán)色顆粒(×400)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R563

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄭錦花;天然抗氧化物拮抗胰島素抵抗的分子靶點(diǎn)篩選[D];吉林大學(xué);2011年

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本文編號：2707881