【摘要】： 第一部分原代大鼠肺泡II型上皮細胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定 背景 肺泡上皮易受各種應激的損傷,它的損傷后修復主要依賴于肺泡上皮的干細胞——肺泡II型上皮細胞(alveolar type II epithelial cells,ATII cells)。ATII細胞體積較小、呈立方形,占肺泡上皮細胞數的60%左右,能通過增殖、鋪展、遷移,并最終轉化為肺泡I型上皮細胞(alveolar type I epithelial cells, ATI cells),恢復肺泡上皮正常的形態(tài)和功能。另外,ATII細胞還具有很多重要功能:合成、分泌和重新利用表面活性物質;轉運離子和水分;合成免疫效應分子。但ATII細胞的原代分離、純化技術較為復雜,本研究的目的是掌握成年大鼠ATII細胞的分離、純化和培養(yǎng)技術,以獲得數量足夠、純度高的ATII細胞,滿足下一步實驗的需要。 目的 確定成年大鼠原代ATⅡ細胞分離1、純化、培養(yǎng)的技術方法,為研究氧化應激下ATⅡ細胞存活、凋亡和信號轉導機制提供數量足夠和高純度的ATⅡ細胞,以滿足實驗的需要。 方法 水合氯醛麻醉清潔級Spraque-Dawley大鼠(約200 g),打開胸腔行肺動脈插管,以生理鹽水沖凈肺血。整體取出心肺和氣管,氣管插管,以緩沖液灌洗肺泡腔10次。將0.08%胰蛋白酶消化液從氣管注入肺泡,置于37°C,5%二氧化碳(carbon dioxide, CO2)培養(yǎng)箱,每隔5分鐘添加適量消化液, 20分鐘后,去除氣管及肺門周圍結締組織置于250μg/ml脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)和終止血清混合液中,快速剪肺至1 mm3小塊,篩網過濾,離心收集細胞, DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞并轉移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中,吸附純化2 h,用含10%胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,接種于6孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板,細胞接種后24h換液,繼續(xù)培養(yǎng)12h備用。臺盼藍拒染法測定細胞活力。透射電鏡(Transmitting electron microscopy, TEM)鑒定細胞,改良巴式染色法確定細胞純度。在體外培養(yǎng)細胞不同的時間(36、72、96和120 h)觀察細胞的性狀和形態(tài)變化。 結果 1.細胞的產量約為2×107個/只大鼠。 2.電鏡下觀察到ATⅡ細胞典型細胞結構——板層小體;改良巴式染色法證實細胞純度 90%。 3.臺盼藍拒染法測定細胞活力 90%。 4.體外培養(yǎng)36至72 h時細胞生長良好,細胞質內有較多顆粒;96 h以后細胞呈長索形,細胞內顆粒減少,并出現空泡。 結論 利用0.08%胰酶消化分離和大鼠Ig免疫粘附純化,可獲得高產量、高純度、高活力的原代ATⅡ細胞,能滿足實驗的需要。ATⅡ細胞體外培養(yǎng)36至72 h時生長良好,可進行體外實驗。 第二部分氧化應激誘導肺泡II型上皮細胞的損傷作用及JNK調控作用 背景 氧氣療法是臨床上治療急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但長時間高氧暴露可引起氧化應激性肺損傷。高濃度氧氣(氧氣體積分數 0.95,簡稱高氧)暴露下產生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是導致氧化應激性肺損傷的主要致病因素。ROS可造成細胞膜脂質的過氧化損傷,蛋白質的應激性修飾,基因的畸變等細胞損傷,導致細胞完整性和功能的破壞。更為重要的是ROS還可通過激活細胞內凋亡信號系統(tǒng)而參與細胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在內的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases, MAPKs)家族信號通路是多種刺激通過細胞膜到達細胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和p38三條信號通路組成,其中JNK信號通路是一條主要的應激信號通路,在調控細胞的生長、凋亡和免疫反應等方面具有重要作用,但JNK信號的作用因細胞種類、刺激類型而有所差異。氧化應激下ATII細胞的凋亡(在肺損傷和纖維化中具有重要作用)可能涉及JNK信號,但JNK信號在其中起的作用尚不清除。 目的 1.采用過氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)和無血清培養(yǎng)基建立原代大鼠ATII細胞的氧化損傷模型。 2.研究H2O2對ATII細胞形態(tài)、存活和凋亡的影響,探討細胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應關系。 3.了解氧化應激下ATII細胞凋亡過程中JNK的活化情況,并采用JNK信號抑制劑預先干預,觀察其是否能有效抑制H2O2誘導的JNK的活化,從而研究JNK對細胞凋亡的作用。 方法 分離、純化清潔級Spraque-Dawley成年大鼠的ATⅡ細胞,臺盼蘭拒染法鑒定細胞活性,改良巴氏染色法鑒定細胞純度。ATⅡ細胞用不同濃度的H2O2(0μM、50μM、100μM、500μM和1000μM)處理3 h;以500μM H2O2處理不同時間(0 h、1 h、3 h、6 h和9 h);采用倒置相差顯微鏡細胞形態(tài)變化,MTT比色法測定細胞存活率,流式細胞術定量檢測凋亡率,以明確細胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應關系。500μM H2O2作用細胞3h后,透射電鏡觀察細胞凋亡改變。western blot檢測500μM H2O2刺激ATⅡ細胞(0、5、10、30、60、180、360和540 min)后p-JNK的表達。在研究JNK信號作用時,細胞隨機分為4組:以無血清培養(yǎng)基作用細胞3h,設為對照組(CON組);25μM SP600125(JNK信號特異性抑制劑)預處理,再以無血清培養(yǎng)基作用細胞3 h,設為CON+SP組;以500μM H2O2作用細胞3h,設為H2O2組;細胞預先加入25μM SP600125(JNK信號特異性抑制劑),再以500μM H2O2刺激3 h,設為H2O2+SP組,檢測細胞的存活率和凋亡率;熒光顯微鏡觀察熒光染料4,6-二咪基-4-聯(lián)苯基吲哚(4',6-Diamidino -2- phenylindole, DAPI)染色后細胞核的形態(tài)變化。 結果 1.不同濃度H2O2刺激ATⅡ細胞3 h后,與對照組(0μM H2O2)比較,10μM H2O2處理組的細胞生長形態(tài)無明顯差異;100μM H2O2處理組細胞間隙稍增寬; 500μM H2O2處理組,細胞間隙增寬,體積略減小,部分細胞核濃縮變小,細胞內顆粒(板層小體)減少,1000μM H2O2處理時,大量細胞出現皺縮,變圓,可見細胞脫壁。在500μM H2O2作用細胞不同時間時,與對照組(0 h H2O2)比較,同樣發(fā)現隨處理時間的延長,細胞的形態(tài)損害隨之加重。 2.透射電鏡觀察發(fā)現500μM H2O2處理3 h后,部分細胞發(fā)生典型凋亡改變:細胞體積減小,胞質濃縮,胞膜內陷,多個凋亡小體圍繞,小體內可見明顯胞核物質。 3.MTT實驗結果表明:與對照組(0μM H2O2)相比,50μM、100μM H2O2處理對ATⅡ細胞存活率無明顯影響(P 0.05),500μM和1000μM H2O2處理后, ATⅡ細胞存活率呈下降明顯(P 0.05)。500μM H2O2處理不同時間后,與對照組(0 h H2O2)比較,隨作用時間的延長,細胞存活率逐漸下降,與對照組相比有顯著差異(P 0.05)。 4.流式細胞術結果顯示:與對照組(0 h H2O2)比較, 500μM H2O2處理ATⅡ細胞不同時間后,隨H2O2作用時間的延長, ATⅡ細胞凋亡率呈明顯上升趨勢(P 0.05)。 5.500μM H2O2刺激后能很快激活JNK,p-JNK的表達在刺激30 min時表達最強,隨后其表達逐漸減弱,SP600125預處理能有效抑制H2O2誘導JNK的活化。 6.與H2O2組(500μM H2O2作用細胞3h組)比較,H2O2+SP組(SP600125預處理,再以500μM H2O2作用細胞3h組)細胞存活率上升而凋亡率下降(P均 0.05)。 7.熒光顯微鏡下發(fā)現DAPI染色后正常對照組ATⅡ細胞細胞核形態(tài)完整,發(fā)出淺藍色熒光,H2O2組細胞多數細胞核濃集、固縮,發(fā)出明亮藍色熒光,而H2O2+SP組細胞核的損傷較H2O2組減輕。 結論 1. H2O2以濃度和時間依賴的方式誘導ATⅡ細胞損傷。 2.通過流式細胞儀和電鏡證實:H2O2刺激可誘導ATⅡ細胞發(fā)生凋亡。 3. JNK參與了氧化應激下ATⅡ細胞凋亡信號轉導,并對ATⅡ細胞起促凋亡的作用。 第三部分JNK對ATII細胞凋亡相關蛋白及核轉錄因子表達或活化的調控作用 背景 目前廣泛認為在高氧暴露過程中產生的ROS是導致氧化應激性肺損傷的主要致病因素,ROS刺激可引起肺組織細胞的凋亡。近年來,ROS對細胞凋亡的調控作用逐漸引起人們的重視。ATⅡ細胞對維持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用,如果它過度凋亡,肺損傷和組織纖維化將不可避免。越來越多的研究者關注ATⅡ細胞的凋亡,但是氧化應激下ATⅡ細胞凋亡的機制尚不明確。第二部分證實了JNK信號通路參與了氧化應激下ATⅡ細胞凋亡信號轉導并對ATⅡ細胞起促凋亡的作用,但JNK究竟通過哪些途徑達到促細胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分進一步研究ROS對肺泡上皮細胞凋亡相關蛋白表達和核轉錄因子活化的影響,并探索JNK信號對凋亡相關蛋白表達和核轉錄因子活化的影響。 目的 1.觀察ROS對ATⅡ細胞線粒體膜電位(Mitochondrial transmembrane potential, MMP)的損傷作用。 2.研究ROS對肺泡上皮細胞凋亡相關蛋白表達和核轉錄因子活化的影響。 3.使用JNK信號抑制劑SP600125,探索JNK信號對氧化應激下ATⅡ細胞凋亡相關蛋白表達和核轉錄因子活化的影響。 方法 Western blot法檢測500μM H2O2刺激前后細胞凋亡相關蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和核轉錄因子NF-κB p65的表達,并采用SP600125阻斷JNK信號活化后,研究JNK信號對以上蛋白表達或活化的影響。熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光染料JC-1染色后線粒體膜電位的變化。Mitotracker Red標記ATⅡ細胞線粒體,免疫熒光技術檢測p53和NF-κB p65,激光共聚焦顯微鏡觀察H2O2刺激前后p53和NF-κB的表達和分布情況。 結果 1. JC-1染色后,熒光顯微鏡下觀察JC-1多聚體(紅色熒光)和單體(綠色熒光)的變化情況,發(fā)現正常對照組細胞發(fā)出鮮艷的紅色熒光,無綠色熒光,500μM H2O2刺激后,紅色熒光逐漸暗淡,綠色熒光逐漸增強;流式細胞儀檢測發(fā)現500μM H2O2刺激后,隨作用時間的延長,紅/綠熒光強度比值逐漸下降。 2. Western blot檢測發(fā)現,與正常對照組比較,500μM H2O2刺激后,隨作用時間的延長,Bax、p53、active caspase-3和NF-κB p65的表達逐漸增加;SP600125預處理可明顯降低H2O2刺激后以上相關蛋白的表達。 3.激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現正常對照組ATⅡ細胞p53和NF-κB p65的表達十分微弱,H2O2刺激后,p53和NF-κB p65的表達明顯增加,并且它們都主要分布在細胞核內;SP600125預處理可明顯降低H2O2刺激后p53和NF-κB p65的核內表達強度。 結論 1. H2O2刺激能破壞ATⅡ細胞線粒體膜電位,隨刺激時間的延長,線粒體膜電位明顯下降。 2. H2O2刺激能通過JNK信號通路,明顯上調凋亡相關蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和轉錄因子(NF-κB)的表達與活化,從而起到促細胞凋亡作用。 第四部分NAC對氧化應激狀態(tài)下肺泡II型上皮細胞的調控作用 背景 既然氧化應激下ROS對細胞的死亡起著關鍵作用,我們認為抗氧化處理可能有助于抑制氧化應激下ATΙΙ細胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)可作為還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione, GSH)合成的前體,在氧化應激下多種細胞的研究中已顯示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC處理能否對氧化應激下ATΙΙ細胞起到保護作用。本研究探討NAC對氧化應激下MAPKs激活的影響和ATΙΙ細胞的保護作用。 目的 1.研究NAC預處理能否對氧化應激下的ATⅡ細胞起保護作用。 2.研究NAC預處理對H2O2刺激后ATⅡ細胞內ROS水平及MAPKs激活的影響。 方法 原代培養(yǎng)的大鼠ATⅡ細胞,隨機分為4組:正常對照組(CON組)、CON+NAC組、H2O2組和H2O2+NAC組。MTT法檢測各組細胞存活率的變化,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率和細胞內ROS水平。Western blot檢測H2O2刺激及NAC干預后p-JNK、p-ERK和p-p38的表達的變化。 結果 1.與正常對照組比較, H2O2組細胞存活率明顯下降(P 0.05),細胞凋亡率明顯上升(P 0.05)。 2.與正常對照組比較, H2O2組ATⅡ細胞內ROS水平上升(P 0.05); H2O2刺激后p-JNK、p-ERK和p-p38的表達也明顯增加(P0.05)。 3.與H2O2組比較,H2O2+NAC組細胞存活率明顯升高(P 0.05),凋亡率明顯下降(P 0.05)。 4.與H2O2組比較,H2O2+NAC組細胞內ROS水平明顯下降(P 0.05),NAC預處理能明顯抑制H2O2誘導的p-JNK、p-ERK和p-p38表達。 結論 氧化應激能激活包括JNK信號在內的MAPKs信號系統(tǒng),上調ATⅡ細胞內的ROS水平,并誘導ATⅡ細胞凋亡;NAC通過降低細胞內ROS和抑制包括JNK在內的MAPKs的活化,減輕氧化應激下ATⅡ細胞的凋亡而對ATⅡ細胞起保護作用。
【圖文】：

圖 1 臺盼藍染色(×100)Fig 1 Trypan blue staining of ATⅡ cells(×100) 改良巴氏染色鑒定細胞：ATⅡ細胞細胞質中含有豐富的深藍

改良巴氏染色鑒定細胞：ATⅡ細胞細胞質中含有豐富的深藍色顆粒(×400)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R563

【引證文獻】

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1 鄭錦花;天然抗氧化物拮抗胰島素抵抗的分子靶點篩選[D];吉林大學;2011年

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本文編號：2707881