【摘要】： 背景與目的： 銅綠假單胞菌肺部感染是醫(yī)院感染死亡的主要原因之一。作為機(jī)會致病菌，銅綠假單胞菌可以根據(jù)環(huán)境改變自身基因表達(dá)，具有極強的適應(yīng)能力和適時多變的毒力，通過與宿主免疫系統(tǒng)相互作用、相互調(diào)節(jié)共同決定著感染的結(jié)局。肺固有免疫系統(tǒng)在銅綠假單胞菌感染中起著重要作用，對其機(jī)制的深入研究對臨床工作有指導(dǎo)意義。為此，本文擬從分子水平、細(xì)胞水平、器官水平研究不同狀態(tài)下同一株銅綠假單胞菌引起感染時宿主固有免疫系統(tǒng)(TLRs和NOD2)的變化和功能，為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。 方法： 1、本研究采用銅綠假單胞菌ATCC 27853通過LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和體外改良平板培養(yǎng)法分別建立浮游菌和生物被膜菌。分別用這兩種狀態(tài)下的菌株作用于人呼吸道上皮細(xì)胞株A549、HBE，構(gòu)建體外感染模型。采用RT-PCR和Western blot方法檢測TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表達(dá)、ELISA法檢測細(xì)胞上清中IL-6、IL-8水平，，應(yīng)用Western blot方法測定浮游菌感染模型中TRAF6、NF-κB蛋白表達(dá)量。 2、采用分別處于上述兩種狀態(tài)的菌株建立大鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型，按隨機(jī)原則將66只SD大鼠分為對照組、浮游菌感染組、生物被膜菌感染組。分別于浮游菌感染組建模后4h、1d、3d，生物被膜菌感染組建模后4h、7d、14d采集標(biāo)本，進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察，采用RT-PCR、Western blot法檢測肺組織TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表達(dá)。 3、浮游菌作用A549細(xì)胞4h后，提取細(xì)胞上清中的分泌蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳，尋找表達(dá)差異顯著的蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 結(jié)果： 1、體外感染模型中，TLR2的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)；TLR4在浮游菌和被膜菌感染4h組表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，TLR5mRNA水平在浮游菌作用的15min即發(fā)生明顯上調(diào)，至作用30min組升至最高點，隨后有下降趨勢(P＜0.05)；TRAF6和NF-κB與TLR5的表達(dá)情況基本一致。IL-6、IL-8水平隨著作用時間的延長逐漸上調(diào)(P＜0.05)。 2、動物感染模型中，浮游菌感染組和被膜菌感染組的病理變化差異明顯。浮游菌感染組中，TLR2的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)；TLR4的表達(dá)在3d組中上調(diào)(P＜0.05)；TLR5水平在4h組顯著增高以后逐漸下調(diào)(P＜0.05)；NOD2的表達(dá)在4h組上調(diào)后恢復(fù)正常(P＜0.05)。生物被膜菌感染組中，TLR2、TLR5、NOD2的表達(dá)逐漸增高(P＜0.05)，TLR4的表達(dá)在d14組明顯增高(P＜0.05)。 3、獲得了分辨率和重復(fù)性較好的雙向凝膠電泳圖譜，取對照組和浮游菌處理組中表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)點進(jìn)行肽質(zhì)指紋分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，表達(dá)差異顯著的蛋白可能為Notchless protein homolog 1，其功能尚未闡明。 結(jié)論： 1、處于不同狀態(tài)下的同一菌株引起感染的病程和結(jié)局不同，銅綠假單胞菌根據(jù)外環(huán)境調(diào)節(jié)自身狀態(tài)在機(jī)會感染中有重要意義 2、不是TLR2／TLR4而是鞭毛蛋白結(jié)合TLR5介導(dǎo)的MyD88／TRAF6／NF-κB信號通路在銅綠假單胞菌感染初始階段起主要作用 3、在銅綠假單胞菌慢性感染中肺固有免疫系統(tǒng)被充分激活
【圖文】：

2.間接免疫熒光法在A549和HBE細(xì)胞中均檢測到TLRZ、TLR4、TLRS、NODZ蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)圖2一1圖2一3圖2一4圖2一5圖2間接免疫熒光法在A抖9中檢測丁LRS、NODZ蛋白l狗表達(dá)情況2小陰性對照(PBS代替一抗);2一2:NODZ;2一3:TLRZ;2一4:TLR4;2一5:TLRS

與L尸S作用4h組比較.:l〕 <0.05，圖3一 6LPS作用組HBE細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)水平 TLR489KDAetl一 143KD、對照組;2、LPS作用211組3、LPS作用4h組圖3一7W亡stern方法檢測TLR4蛋白表達(dá)水平一____五___住 123自曰門曰日自枕崛一王恤肖從對照組:2、LPS作用211組:3、LPS△:P<0.05，與對照組比較;▲與LPS作用4h組比較作用41飛組P<0.05，與LPS作用Zh組比較;，:P<0.05，圖3一 8LPS作用組HBE細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)水平 3.3LPS刺激HBE細(xì)胞引起NODZ表達(dá)上調(diào)100ng/mlLPS蛋白刺激HBE，細(xì)胞內(nèi)NODZ的表達(dá)隨時間增加上調(diào)(尸<0.05，=3)。(見圖3一9、10) M123 22()bPGAPDH ]57bPNODZ M:Markerl()ObPladder:圖3一9l、對照組:2、LPS作用Zh組3、LPS作用4h組RT-PCR方法檢測NODZmRNA的表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R563.1

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本文編號：2703123