【摘要】： 第一部分蛋白激酶Cα和周期蛋白D1在吸煙患或不患慢性阻塞性肺疾病患者肺血管中的表達(dá)變化 目的檢測(cè)蛋白激酶Cα(PKCα)和周期蛋白D1 (cyclinD1)在吸煙患或不患慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺血管中的表達(dá)變化并探討兩者在吸煙導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)中的作用。方法將35例因肺癌而行肺葉切除術(shù)患者的外周肺組織標(biāo)本分為三組：不吸煙肺功能正常組(正常組)10例,吸煙肺功能正常組(吸煙組)14例,吸煙伴COPD組(COPD組)11例。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、PKCα和cyclinD1蛋白表達(dá),以PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)(PI),采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中]PKCa mRNA、cyclin D1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1)肺小動(dòng)脈血管壁面積占血管總面積的百分比值(WA%)在吸煙組和COPD組均高于正常組。(2)吸煙組和COPD組PI均高于正常組(P0.01)。(3)吸煙組、COPD組PKCa蛋白和cyclinD1蛋白表達(dá)吸光度(A)值較正常組均顯著升高(P0.01)。(4)吸煙組、COPD組PKCa mRNA和cyclinD1 mRNA表達(dá)水平較正常組均顯著升高(P0.01)。(5)PKCa蛋白表達(dá)水平分別與WA%、PI呈正相關(guān)(P0.01),cyclinD1蛋白表達(dá)水平分別與WA%、PI呈正相關(guān)(P0.01),PKCa與cyclin D1在蛋白和mRNA表達(dá)水平均呈明顯正相關(guān)(P0.01)。結(jié)論在吸煙者及早期COPD患者肺血管中PKCa和cyclinD1表達(dá)均顯著上調(diào),二者可能參與肺血管重構(gòu)中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖。 第二部分周期蛋白D1在香煙煙霧提取物促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用 目的本文旨在探討周期蛋白D1(cyclinD1)在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)所致人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMCs)增殖中的作用。方法用不同濃度的CSE(1%,2.5%,5%,10%,20%)干預(yù)同步化的HPASMCs。構(gòu)建反義cyclin D1基因真核表達(dá)載體(pIRES2-EGFP-ascyclin D1),采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法將空載體(pIRES2-EGFP)和pIRES2-EGFP-ascyclin D1導(dǎo)入正常HPASMCs后,分別進(jìn)行CSE(5%)干預(yù)。細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、空載體組、反義cyclinD1組、5%CSE組、空載體+5%CSE組、反義cyclin D1+5% CSE組。用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)不同濃度CSE干預(yù)的HPASMCs活細(xì)胞率,采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色法測(cè)定細(xì)胞增殖能力,用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果低濃度的CSE(1%,2.5%,5%,10%)促進(jìn)HPASMCs增殖,且濃度5%時(shí)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),高濃度的CSE(20%)對(duì)HPASMCs具有毒性作用,抑制細(xì)胞增殖。反義cyclin D1基因真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-ascyclin D1成功構(gòu)建,并成功轉(zhuǎn)染入HPASMCs,轉(zhuǎn)染后HPASMCs中cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著下降(P0.05)。與對(duì)照組比較,5%CSE組cyclin D1的nRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P0.05),細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P0.05)。與5%CSE組比較,反義cyclin D1+5% CSE組cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P0.05),細(xì)胞增殖能力顯著降低(P0.05)。結(jié)論CSE可通過上調(diào)cyclin D1表達(dá)促進(jìn)HPASMCs增殖,反義cyclin D1基因真核表達(dá)載體可抑制CSE介導(dǎo)的HPASMCs增殖,提示cyclin D1在CSE促進(jìn)HPASMCs增殖中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。 第三部分蛋白激酶Cα和周期蛋白D1在香煙煙霧提取物促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用和關(guān)系 目的研究蛋白激酶Cα(PKCα)和周期蛋白D1(cyclin D1)在香煙煙霧提取物(CSE)促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMCs)增殖中的作用和關(guān)系。方法用5%濃度的CSE干預(yù)同步化的HPASMCs。通過Western blot法檢測(cè)PKCα蛋白在胞漿和胞膜中的表達(dá)。采用小干擾RNA (siRNA)技術(shù)分別剔除PKCα和cyclin D1基因表達(dá)。用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)cyclin D1 mRNA表達(dá),Western blot法檢測(cè)PKCα和cyclin D1蛋白的表達(dá)。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化。結(jié)果5%CSE可激活PKCα,PKCα蛋白由胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜表達(dá)。通過Go6976抑制PKCα活性或采用siRNA技術(shù)剔除PKCα基因表達(dá)可顯著抑制CSE介導(dǎo)的HPASMCs增殖和細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換。5%CSE促進(jìn)HPASMCs增殖中,cyclin D1mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。轉(zhuǎn)染cyclin D1 siRNA可抑制CSE介導(dǎo)的HPASMCs增殖。此外,使用Go6976或轉(zhuǎn)染PKCa siRNA可顯著抑制CSE介導(dǎo)的HPASMCs中cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論香煙煙霧提取物通過蛋白激酶Cα途徑上調(diào)周期蛋白D1表達(dá)促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。
【圖文】：

肺血管形態(tài)學(xué)特征(HE)

肺血管中a一SMA表達(dá)(DAB顯色)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：2701930