【摘要】： 研究背景 氣道黏液高分泌是哮喘(asthma)、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructivepulmonary diseases,COPD)、囊性纖維化(Cystic fibrosis,CF)等慢性氣道疾病共同的重要病理特征,但目前仍缺乏有效的治療手段。闡明氣道黏液合成的調(diào)控機(jī)制,將為氣道黏液高分泌提供新的靶點(diǎn)治療,對(duì)開(kāi)發(fā)有效抑制氣道黏液高分泌的新藥物具有重要意義。 黏蛋白MUC5AC是氣道黏液的主要成分,所以研究其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尤為重要。多種細(xì)菌均可誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)上調(diào),包括致呼吸道感染的常見(jiàn)細(xì)菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),但目前PA-LPS上調(diào)氣道黏蛋白MUC5AC的分子機(jī)制尚未闡明。既往研究雖證實(shí)PA-LPS通過(guò)腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(Tumornecrosis factorαconverting enzyme,TACE)→轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(Transforminggrowth factor-α,TGF-α)→表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)通路誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC高表達(dá),但對(duì)于PA-LPS通過(guò)何種信號(hào)途徑導(dǎo)致TACE活化進(jìn)而激活下游的信號(hào)分子尚未明確。最近有研究發(fā)現(xiàn)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可直接活化TACE,并闡明ROS→TACE→TGF-α→EGFR信號(hào)通路介導(dǎo)香煙煙霧、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)。鑒于既往研究顯示LPS可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞ROS的合成,故本課題設(shè)想ROS也在PA-LPS上調(diào)氣道MUC5AC中具有關(guān)鍵作用。 NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)是調(diào)控細(xì)胞ROS合成的主要酶蛋白之一,Nox家族包括多種同源蛋白,其中在氣道上皮細(xì)胞表達(dá)的為Dual oxidase(Duox,包括兩種亞型Duox1及Duox2),研究表明Duox負(fù)責(zé)調(diào)控氣道上皮細(xì)胞ROS的合成,那么Duox是否參與了MUC5AC表達(dá)的調(diào)控?最近研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)可激活Duoxl,并闡明PKC→Duox1→ROS→TACE→TGF-α→EGFR信號(hào)通路介導(dǎo)NE上調(diào)MUC5AC,所以本課題擬探討該通路在PA-LPS誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)中的重要作用。 LPS通過(guò)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)誘導(dǎo)各種病理生理反應(yīng),最近一系列研究證實(shí)TLR4與Nox家族存在信號(hào)串話,如Park HS等通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)證實(shí)TLR4與Nox4存在信號(hào)串話,并介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)T細(xì)胞ROS的生成;又如Pacquelet S等揭示TLR4可以通過(guò)其下游的IRAK磷酸化Nox4的胞漿組分p47phox,進(jìn)一步闡明了TLR4與Nox4信號(hào)串話的分子機(jī)制。因此本課題設(shè)想PA-LPS可能通過(guò)TLR4與Duox1的信號(hào)串話誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá)。 本課題擬探討TLR4、PKC、Duox1、ROS在PA-LPS誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC表達(dá)中的重要作用及其相互關(guān)系,進(jìn)一步闡明PA-LPS上調(diào)氣道黏蛋白MUC5AC表達(dá)的分子機(jī)制。 第一部分:ROS在PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用 目的 探討ROS在PA-LPS誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞TGF-alpha合成、黏蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用。 方法 以PA-LPS干預(yù)氣道黏液上皮癌細(xì)胞株NCI-H292細(xì)胞,干預(yù)2h后檢測(cè)細(xì)胞上清液H_2O_2的生成;干預(yù)4h后ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中TGF-alpha的含量;干預(yù)12h后RT-PCR檢測(cè)MUC5AC mRNA的表達(dá);干預(yù)24h后免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞MUC5AC蛋白的表達(dá)。采用ROS清除劑二甲基硫脲(1,3-dimethyl-2-thiourea,DMTU)預(yù)先干預(yù)NCI-H292細(xì)胞30min,然后再加入PA-LPS共同干預(yù)細(xì)胞并檢測(cè)TGF-alpha的生成、MUC5AC mRNA及蛋白的表達(dá)情況。以含MUC5AC 5'端3.7kb的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pMUC5AC 3.7kb-luc)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HM3細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后分別以PA-LPS及不同濃度的H_2O_2干預(yù)5h,然后液閃計(jì)數(shù)儀下檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度以明確MUC5AC的轉(zhuǎn)錄活性。以DMTU預(yù)先干預(yù)轉(zhuǎn)染的HM3細(xì)胞30min,再加入PA-LPS共同干預(yù)5h,然后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度。 結(jié)果 PA-LPS干預(yù)后,NCI-H292細(xì)胞上清液中H_2O_2、TGF-alpha的含量、細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白水平的表達(dá)均明顯上調(diào)(p＜0.01)。ROS清除劑DMTU可明顯抑制PA-LPS對(duì)NCI-H292細(xì)胞TGF-alpha、MUC5AC mRNA及蛋白水平表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01)。PA-LPS及不同濃度的H_2O_2均明顯上調(diào)MUC5AC 3.7kb-luc轉(zhuǎn)染的HM3細(xì)胞中MUC5AC的轉(zhuǎn)錄活性,DMTU也可明顯抑制PA-LPS及H_2O_2對(duì)MUC5AC轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。 結(jié)論 ROS可通過(guò)調(diào)控TGF-alpha的合成介導(dǎo)PA-LPS對(duì)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)的上調(diào),而且ROS也介導(dǎo)了PA-LPS對(duì)MUC5AC轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。因此本研究表明氧化應(yīng)激在PA-LPS導(dǎo)致的氣道黏液高分泌中具有關(guān)鍵作用。 第二部分:TLR4-PKC-Duox1信號(hào)通路在PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用 目的 探討TLR4-PKC-Duox1信號(hào)通路在PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞ROS、TGF-alpha合成及黏蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用。 方法 分別采用Nox的抑制劑Apocynin、PKC的抑制劑BisindolylmaleimideⅠ預(yù)先干預(yù)NCI-H292細(xì)胞30min,然后再加入PA-LPS共同干預(yù)細(xì)胞,干預(yù)2h后檢測(cè)細(xì)胞上清液H_2O_2的生成;干預(yù)4h后ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中TGF-alpha的含量;干預(yù)12h后RT-PCR檢測(cè)MUC5AC mRNA的表達(dá);干預(yù)24h后免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞MUC5AC蛋白的表達(dá)。分別以Apocynin、BisindolylmaleimideⅠ預(yù)先干預(yù)pMUC5AC 3.7kb-luc轉(zhuǎn)染的HM3細(xì)胞30min,再加入PA-LPS共同干預(yù)5h,然后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度以明確MUC5AC的轉(zhuǎn)錄活性。以PA-LPS干預(yù)NCI-H292細(xì)胞,RT-PCR分別檢測(cè)干預(yù)6h、12h、24h后Duox1mRNA的表達(dá)水平,以明確PA-LPS是否上調(diào)Duox1的表達(dá)。分別采用Duox1、TLR4的siRNA、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Duox1、TLR4mRNA的表達(dá)情況以確定siRNA對(duì)A549細(xì)胞Duox1、TLR4表達(dá)的抑制效率,并篩選出抑制效率最高的Duox1、TLR4 siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后加入PA-LPS干預(yù),并同前方法檢測(cè)干預(yù)后H_2O_2、TGF-alpha的生成、MUC5AC mRNA及蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 Nox的抑制劑Apocynin、PKC的抑制劑BisindolylmaleimideⅠ均明顯抑制PA-LPS對(duì)NCI-H292細(xì)胞上清液中H_2O_2及TGF-alpha的上調(diào)(p＜0.01);明顯抑制PA-LPS對(duì)NCI-H292細(xì)胞MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01);Apocynin及BisindolylmaleimideⅠ均明顯抑制PA-LPS對(duì)pMUC5AC 3.7kb-luc轉(zhuǎn)染的HM3細(xì)胞中MUC5AC轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。PA-LPS分別干預(yù)A549細(xì)胞6h、12h、24h后,Duox1mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,表明PA-LPS可能通過(guò)增強(qiáng)Duox1的酶活性以對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。Duox1及TLR4的siRNA均有效抑制A549細(xì)胞Duox1、TLR4mRNA的表達(dá),分別下調(diào)二者mRNA表達(dá)水平約75%。同時(shí)Duox1及TLR4的siRNA均明顯抑制PA-LPS對(duì)A549細(xì)胞上清液中H_2O_2及TGF-alpha的上調(diào)(p＜0.01);明顯抑制PA-LPS對(duì)A549細(xì)胞MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01)。 結(jié)論 TLR4、PKC、Duox1均可通過(guò)對(duì)ROS、TGF-alpha的調(diào)控以介導(dǎo)PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá)。PKC、Duox1均可在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)PA-LPS誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。本研究表明可能存在TLR4-PKC-Duox1信號(hào)通路調(diào)控PA-LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞ROS合成,進(jìn)而通過(guò)ROS及其下游的信號(hào)通路TACE—TGF-alpha—EGFR調(diào)控黏蛋白MUC5AC的表達(dá)。 總結(jié) 通過(guò)對(duì)PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC分子機(jī)制的研究,得出以下結(jié)論: 1.ROS可通過(guò)調(diào)控TGF-alpha的合成介導(dǎo)PA-LPS對(duì)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)的上調(diào),而且ROS也介導(dǎo)了PA-LPS對(duì)MUC5AC轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。因此本研究表明氧化應(yīng)激在PA-LPS導(dǎo)致的氣道黏液高分泌中具有關(guān)鍵作用。 2.TLR4、PKC、Duox1均可通過(guò)對(duì)ROS、TGF-alpha的調(diào)控以介導(dǎo)PA-LPS上調(diào)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá),而且PKC、Duox1均可在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)PA-LPS誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。 3.本研究表明可能存在TLR4—PKC—Duox1信號(hào)通路調(diào)控PA-LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞ROS合成,進(jìn)而通過(guò)ROS及其下游的信號(hào)通路TACE—TGF-alpha—EGFR調(diào)控黏蛋白MUC5AC的表達(dá)。
【圖文】：

DMTU(25n1M)干預(yù)后，PA一LPS誘導(dǎo)的 MUCSACmRNA表達(dá)減少約70%(夕<0.01)(圖2、圖3)，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示DMTU干預(yù)后MUCSAe蛋白的表達(dá)也顯著減少(圖4)。

DMTU(25n1M)干預(yù)后，PA一LPS誘導(dǎo)的 MUCSACmRNA表達(dá)減少約70%(夕<0.01)(圖2、圖3)，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示DMTU干預(yù)后MUCSAe蛋白的表達(dá)也顯著減少(圖4)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R56

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697429