MSCs分泌的微泡通過轉(zhuǎn)移線粒體促進(jìn)PMVECs修復(fù)的研究

發(fā)布時間：2020-06-04 00:38

【摘要】：研究目的:研究間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分泌的微泡(MVs)通過轉(zhuǎn)移線粒體對受損肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)的修復(fù)作用。研究方法:(1)為篩選出濃聚線粒體的最佳培養(yǎng)條件,將MSCs置于常氧(21%O_2)及低氧(1%O_2)條件下分別培養(yǎng)24、48、72h后提取上清,使用差速離心法將上清中的微泡分離提取出來,電鏡下觀察MVs的形態(tài)及大小,流式分析MV表面標(biāo)志物,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法測定MVs的蛋白濃度,JC-1判斷細(xì)胞凋亡,Western blot檢測線粒體相關(guān)蛋白(CYP1A1、CYP1A2)的表達(dá)。(2)為觀察MVs中線粒體向PMVECs中轉(zhuǎn)移,分別用熒光染料染MSC-MVs和PMVECs的線粒體,在共聚焦熒光顯微鏡下觀察線粒體的轉(zhuǎn)移情況;將MSCs、MVs與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)損傷的PMVECs共培養(yǎng),分為EC組、EC+LPS組、EC+LPS+MSC組、EC+LPS+MV組,Western blot檢測共培養(yǎng)后內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白的變化。(3)為評估線粒體對受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用,我們使用羅丹明-6G(rho)抑制線粒體呼吸鏈,用JC-1及ROS試劑盒評估線粒體功能是否被抑制。然后將MSCs、MVs、MVs-rho與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)損傷的PMVECs共培養(yǎng),分為EC組、EC+LPS組、EC+LPS+MSC組、EC+LPS+MV組和EC+LPS+MV-rho組,Western blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞合成(iNOS、eNOS)及連接蛋白(VE-cadherin)的表達(dá),FITC-葡聚糖法檢測內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,流式檢測內(nèi)皮細(xì)胞的早期和晚期凋亡率,JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位,ELISA檢測炎癥因子(IL-6、IL-10)水平,ROS試劑盒評估活性氧簇的變化。研究結(jié)果:(1)電鏡觀察常氧及低氧均能分離出直徑為100~1000nm之間的圓形/卵圓形膜性結(jié)構(gòu)的MVs;流式檢測MVs表面標(biāo)志物CD44和CD29均呈陽性表達(dá),表達(dá)率分別為97.6%和95.9%,CD34為陰性表達(dá);24h常氧培養(yǎng)為分離MVs、線粒體濃度的最佳培養(yǎng)條件。(2)共聚焦顯微鏡下直視看到MSC-MVs中的線粒體能夠向PMVECs轉(zhuǎn)移;Western blot結(jié)果顯示MSC及MV組均能顯著增加PMVECs中CYP1A1和CYP1A2的蛋白表達(dá)。(3)使用羅丹明-6G后,線粒體膜電位及ROS顯著降低;與LPS損傷組相比,MSC、MV共培養(yǎng)組可以顯著改善內(nèi)皮細(xì)胞合成(iNOS、eNOS),增加抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的水平,降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性,降低早期凋亡率以及活性氧水平,內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白(VE-cadherin)的表達(dá)較LPS組相比有升高趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;MV-rho組與MSC組、MV組相比,內(nèi)皮細(xì)胞合成蛋白以及抗炎因子的表達(dá)顯著降低,內(nèi)皮細(xì)胞通透性、早期凋亡率、活性氧的水平顯著升高,內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)較MSC、MV組相比有降低趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)論:MSCs可以通過MVs向PMVECs轉(zhuǎn)移線粒體,并減輕PMVECs的損傷。
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