【摘要】：一、COPD大鼠外周血EPCs功能變化目的復制COPD大鼠模型,提取大鼠外周血EPCs體外培養(yǎng)并鑒定,觀察COPD對EPCs增殖、黏附、遷移、周期和凋亡功能的影響。方法應用熏煙聯(lián)合氣管注入內毒素干預健康雄性SD大鼠復制COPD模型,通過對肺泡灌洗液炎癥細胞計數(shù)和肺組織病理染色判斷COPD模型是否構建成功。腹主動脈采血后用密度梯度離心法從大鼠外周血中獲取單個核細胞,將其接種在加有細胞載玻片的六孔板上,應用EBM-2專用培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,待細胞貼壁分化后,通過FITC標記的UEA-1的吸附和內吞Dil-ac-LDL鑒定細胞。應用CCK-8試劑盒鑒定EPCs增殖和黏附功能,應用transwell觀察細胞遷移功能,應用流式細胞儀檢測EPCs周期和凋亡情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS.20統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。結果通過煙熏聯(lián)合注射LPS方法,肺泡灌洗液炎細胞計數(shù)和病理結果證明COPD大鼠模型成功復制;經(jīng)FITC標記的UEA-1的吸附和內吞Dil-ac-LDL鑒定出分離培養(yǎng)細胞的為EPCs。通過CCK-8方法測得COPD大鼠組EPCs的增殖能力較對照組顯著降低(P0.01);黏附實驗測得COPD組EPCs的黏附能力較對照組顯著降低(P0.01);transwell測得COPD組EPCs的遷移能力較對照組顯著降低(P0.00);COPD組較對照組G_0G_1期EPCs顯著增多(P0.01),S期和G_2M期EPCs顯著減少(P0.01;P0.05);COPD組EPCs凋亡率明顯高于對照組(P0.05)。結論COPD大鼠外周血中EPCs增殖,遷移、粘附功能降低,細胞周期多阻滯在G_0G_1期,S期和G_2M期細胞減少,細胞凋亡率顯著增加。二、Sirt1對EPCs增殖、遷移、黏附、周期及凋亡的影響第一節(jié)EPCs表達Sirt1目的明確Sirt1在EPCs中表達。方法體外培養(yǎng)COPD大鼠組及對照組外周血EPCs,通過PCR、Westernblot及細胞免疫熒光的方法測定EPCs表達Sirt1。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS.20統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。結果COPD大鼠EPCs上Sirt1mRNA的表達顯著低于對照組細胞(P0.01)。COPD組和對照組EPCs細胞均可檢Sirt1蛋白條帶,經(jīng)WCIF ImageJ圖像分析軟件分析,以β-actin標化后的COPD大鼠細胞Sirt1蛋白表達強度顯著低于對照組細胞(P0.01)。COPD大鼠和對照組Sirt1在共聚焦顯微鏡下觀察:兩組細胞均表達Sirt1,Sirt1在COPD大鼠熒光強度顯著低于對照組。結論Sirt1在COPD組及對照組EPCs內均有表達,且COPD組顯著低于對照組。第二節(jié)Sirt1對EPCs增殖、遷移、黏附、周期及凋亡的影響目的觀察Surt1對EPCs增殖、黏附、遷移、周期和凋亡功能的影響。方法應用Sirt1的激動劑(SRT1720)和攜有Sirt1病毒慢病毒的轉染EPCs方法使Sirt1過表達稱為激動劑組,應用Sirt1抑制劑(EX527)降低EPCs內Sirt1表達稱為抑制劑組,應用CCK-8試劑盒鑒定EPCs增殖和黏附功能,應用并通過transwell小室觀察細胞遷移功能,應用流式細胞儀檢測EPCs周期和凋亡情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS.20統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。結果激動劑和攜帶Sirt1慢病毒轉染提高Sirt1表達后EPCs增殖能力較COPD組顯著增加(P0.05;P0.05),抑制劑組增殖能力較COPD組顯著降低(P0.05)。激動劑組EPCs的黏附能力較COPD顯著增加(P0.01),抑制劑組黏附能力較COPD組降低,但是沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。激動劑組EPCs的遷移能力較COPD顯著降低(P0.0001),抑制劑組遷移能力較COPD組顯著降低(P0.001)。激動劑組較COPD組G_0G_1期EPCs顯著減少(P0.001),S期和G_2M期EPCs顯著增多(P0.01;P0.01),抑制劑組較COPD組G_0G_1期EPCs顯著增加(P0.05),S期和G_2M期EPCs減少,但是沒有統(tǒng)計學意義(P0.05;P0.05)。激動劑組EPCs凋亡率較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組EPCs凋亡率較COPD組顯著增高(P0.01)。結論Sirt1過表達時對EPCs增殖、黏附、遷移功能具有促進作用,細胞凋亡減少,Sirt1表達降低時會抑制EPCs增殖、黏附、遷移功能具有促進作用,細胞凋亡增加。三、Sirt1對NF-KB,FOXO3a,P53基因的影響目的通過改變Sirt1表達后觀察COPD大鼠的EPCs Sirt1、FOXO3a、p53及NF-kB的表達,并觀察COPD和對照大鼠肺組織內Sirt1及FOXO3a,p53,NF-kB的表達,探討Sirt1和FOXO3a、NF-KB、P53之間的關系。方法提取對照組、COPD組、激動劑組和抑制劑組EPCs的mRNA、蛋白質通過qPCR方法和蛋白印跡方法檢測EPCs內Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表達,并制備細胞爬片,通過免疫熒光的方法觀察Sirt1在EPCs的表達。將復制成功的COPD大鼠和正常組大鼠肺組織取出后分別提取RNA、蛋白質和制成石蠟包塊;通過qPCR方法、蛋白印跡方法和免疫熒光的方法檢測肺組織內Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表達。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS.22統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。結果通過qPCR測得COPD組中EPCs Sirt1的mRNA相對表達量較對照組明顯降低(P0.01),激動劑組Sirt1 mRNA的表達量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組Sirt1 mRNA表達量較COPD組顯著降低(P0.05);通過qPCR測得COPD組中EPCs FOXO3a的mRNA相對表達量較對照組明顯降低(P0.01),激動劑組FOXO3a mRNA的表達量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組FOXO3a mRNA表達量較COPD組顯著降低(P0.05);通過qPCR測得COPD組中EPCs NF-KB的mRNA相對表達量較對照組明顯升高(P0.01),激動劑組NF-KB mRNA的表達量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組NF-KB mRNA表達量較COPD組顯著降低(P0.0001);通過qPCR測得COPD組中EPCs P53的mRNA相對表達量較對照組明顯升高(P0.001),激動劑組P53 mRNA的表達量較COPD組顯著降低(P0.001),抑制劑組P53 mRNA表達量較COPD組顯著降低(P0.01)。通過Western blote測得COPD組中EPCs Sirt1蛋白表達量較對照組明顯降低(P0.01),激動劑組Sirt1蛋白表達量較COPD組顯著增高(P0.05),抑制劑組Sirt1蛋白表達量較COPD組顯著降低(P0.01);通過Western blote測得COPD組中EPCs FOXO3a蛋白表達量較對照組明顯降低(P0.01),激動劑組FOXO3a蛋白表達量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組FOXO3a蛋白表達量較COPD組顯著降低(P0.01);通過Western blote測得COPD組中EPCs NF-KB蛋白表達量較對照組明顯升高(P0.05),激動劑組NF-KB蛋白表達量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組NF-KB蛋白表達量較COPD組增高,但沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);通過Western blote測得COPD組中EPCs P53蛋白表達量較對照組明顯升高(P0.01),激動劑組P53蛋白表達量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組P53蛋白表達量較COPD組顯著增高(P0.01)。通過細胞免疫熒光方法觀察到COPD組Sirt1在EPCs表達較對照組降低,激動劑組Sirt1在EPCs中的表達較COPD組顯著,抑制劑組Sirt1在EPCs中的表達較COPD組降低;通過細胞免疫熒光方法觀察到COPD組FOXO3a在EPCs表達較對照組降低,激動劑組FOXO3a在EPCs中的表達較COPD組增加,抑制劑組FOXO3a在EPCs中的表達較COPD組降低;通過細胞免疫熒光方法觀察到COPD組NF-KB在EPCs表達較對照組增加,激動劑組NF-KB在EPCs中的表達較COPD組降低,抑制劑組NF-KB在EPCs中的表達較COPD組增加;通過細胞免疫熒光方法觀察到COPD組P53在EPCs表達較對照組增加,激動劑組P53在EPCs中的表達較COPD組降低,抑制劑組P53在EPCs中的表達較COPD組增加。同時我們測定COPD組肺組織Sirt1 mRNA的相對表達量較對照組顯著低降低(P0.05),COPD組FOXO3a肺組織中mRNA的相對表達量也顯著低于對照組(P0.05),NF-KB在肺組織中Sirt1 mRNA的表達顯著高于對照組(P0.001);而P53的mRNA在肺組織中的表達量也顯著高于對照組。COPD組大鼠肺組織中SIRT1蛋白質的表達量顯著低于對照組(P0.05);FOXO3a在肺組織中的表達量也顯著低于對照組(P0.05);而NF-KB蛋白表達量COPD組顯著高于對照組(P0.0001);P53在COPD組大鼠肺組織的表達量是顯著降低的(P0.05)。通過免疫熒光方法測定COPD組肺組織內SIRT1的表達量較對照組顯著降低(P0.001);COPD組肺組織內FOXO3a表達量較對照組顯著降低(P0.001),COPD組NF-KB表達量較對照組顯著升高(P0.001),COPD組P53的表達量較對照組的表達量也是顯著升高的(P0.05)。結論Sirt1對EPCs功能的影響主要是通過Sirt1/FOXO3a/NF-KB/P53信號通路,但是在COPD大鼠體內P53蛋白可能還受其它蛋白調控。
【圖文】：

細胞的可用于以用于后續(xù)實驗研究。但是）圖 1-5。圖1-5 EPCs細胞生長曲線FITC-UEA-I和 96h 測定可用于以用于后續(xù)實驗研究。但是 COPD 組生長

浸洗爬片 3 次，1 次/3min；（7）復染核：滴加 DAPI 避光室溫孵育 5min 后用 PBST 5min×4 次洗去多余的 DAPI；（8）用吸水紙吸干 PBST，用指甲油封片，然后在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。2.1.1.4 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學處理用 SPSS20 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以 x±s 表示，組間比較采用 t-test，，P< 0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。2.1.2 結果2.1.2.1 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的表達通過對 qPCR 方法測定 COPD 組 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的相對表達量，結果對照組和實驗組均有表達，且實驗組表達較對照組顯著低降低（P＜0.01），可見圖 1，2；圖 2-1
【學位授予單位】：海南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.9

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