【摘要】： 目的: 黏液高分泌和中性粒細胞聚集是氣道慢性炎癥性疾病的重要病理特征,前者導致黏液潴留從而引起并加重病變氣道的阻塞,同時為細菌定植氣道提供良好的培養(yǎng)基;而后者可釋放多種促分泌因子加劇前述過程[1,2,3]。目前認為具有組織溶解性的中性粒細胞彈力酶(neutrophil elastase,NE)可強烈誘導黏液主要組成成分黏蛋白(MUC)表達增加,而MUC5AC作為炎癥氣道粘蛋白的主要特征性表型,決定著高分泌黏液的病理特性[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC的異常表達可被多種體內(nèi)的炎癥介質(zhì)和細胞外因素等所誘導,而各種因素誘發(fā)MUC5AC表達增加的機制最終被定位在MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄增強導致MUC5AC蛋白的合成增加[6,7,8]。近年來,有關(guān)MUC5AC基因表達機制的研究已經(jīng)開展,但其確切機制尚未闡明。本研究通過探討NE對人氣道上皮細胞來源的肺腺癌細胞株A549細胞MUC5AC產(chǎn)生和mRNA表達的影響,以及MUC5AC基因5’上游序列的調(diào)控元件在該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用,從而進一步闡明NE在氣道慢性炎癥性疾病黏液高分泌中的分子機制,并為能從基因和分子水平尋找有效的防治措施提供實驗資料。 方法: MUC5AC在A549細胞中的表達:體外培養(yǎng)A549細胞,加入不同濃度NE作用不同時間。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在蛋白質(zhì)水平檢測培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白含量;以RT-PCR的方法半定量測定A549細胞MUC5AC mRNA表達水平。 設(shè)計、構(gòu)建MUC5AC基因5’上游序列系列截短的熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒:根據(jù)MUC5AC基因5’調(diào)控區(qū)的DNA序列及表達載體pGL3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點及實驗需要設(shè)計PCR擴增引物。從人的基因組總DNA分離出MUC5AC基因5’非編碼區(qū)大小為1300bp的啟動子片段,并以此為模板對其進行5’端刪除分析。MUC5AC基因5’上游序列系列截短的熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實構(gòu)建成功后,用脂質(zhì)體將報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞,連續(xù)培養(yǎng)24h后加NE(濃度為100 nM)處理,孵育24h收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定報告基因的表達水平。 運用序列分析法和聚合酶鏈反應(yīng)對構(gòu)建質(zhì)粒上的兩個順式調(diào)控元件分別進行定點突變:應(yīng)用序列分析法確定據(jù)轉(zhuǎn)錄起始點約80bp和220bp分別含有順式作用元件SP-1序列GGCCCCGCCC和NF-кB序列GGGGAGGACCCCT,設(shè)計兩對導入定點突變引物,采用定點突變技術(shù)分別構(gòu)建Sp-1及NF-κB位點的單獨突變體,含人MUC5AC基因順式調(diào)控元件定點突變序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實構(gòu)建成功后,用脂質(zhì)體將報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞,連續(xù)培養(yǎng)24h后加NE(濃度為100 nM)處理,孵育24小時收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定報告基因的表達水平。 結(jié)果: 1、用ELISA法檢測A549細胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白的表達,10、50、100nM NE處理A549細胞5、10、30min,相同時間點不同濃度NE組MUC5AC蛋白表達水平分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.406～20.909,P均0.05),且呈時間、劑量依賴的趨勢(P0.01)。用RT-PCR的方法檢測MUC5AC mRNA表達,100 nM NE處理30min后A549細胞MUC5ACmRNA相對表達量明顯高于對照組(t=10.299,P0.01)。 2、成功構(gòu)建了4種含有MUC5AC基因啟動子序列系列截短的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,用真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將四種含人MUC5AC基因啟動子序列系列截短的報告基因質(zhì)粒導入A549細胞,然后用NE刺激轉(zhuǎn)染的A549細胞,觀察到NE可分別誘導含有啟動子序列-1330bp(PGL3E-1330/+48)(P0.05) , -689bp(PGL3E -689/+48) (P 0.05) ,-324bp(pGl3E-324/+48)(P0.05)的熒光素酶基因表達,而NE不能誘導pGL3E-MUC5AC-64/+48表達熒光素酶活性(P0.05)。 3、MUC5AC基因啟動子中的順式作用元件下游NF-κB結(jié)合位點和SP-1結(jié)合位點分別位于-220bp和-80bp附近。將兩種分別含有NF-κB結(jié)合位點和SP-1結(jié)合位點發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞并用NE誘導,觀察到NE可促使含有MUC5AC啟動子中NF-κB結(jié)合位點發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒表達熒光素酶,而含有SP-1結(jié)合位點發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒對NE誘導無明顯反應(yīng)。 結(jié)論: 1、NE可誘導A549細胞MUC5AC產(chǎn)生及其mRNA表達,且呈時間和劑量依賴的趨勢,表明NE在基因轉(zhuǎn)錄水平誘導MUC5AC表達。 2、成功地構(gòu)建了四種含人MUC5AC基因系列截短的啟動子序列和兩種含順式作用元件發(fā)生定點突變序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,為研究NE及其他因素誘導MUC5AC基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。 3、NE可分別誘導含有MUC5AC啟動子-1330/+48、-689/+48、-324/+48序列的報告基因質(zhì)粒表達熒光素酶,而含有-64/+48序列的報告基因質(zhì)粒對NE誘導無反應(yīng),表明NE誘導MUC5AC基因表達依賴于啟動子中-324bp和-64bp之間的序列。 4、NE可促使MUC5AC啟動子-324bp至-64bp序列中NF-κB結(jié)合位點發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒表達熒光素酶,而含有SP-1結(jié)合位點發(fā)生定點突變序列的報告基因質(zhì)粒對NE誘導無明顯反應(yīng),提示NE誘導MUC5AC基因表達主要依賴于其啟動子中的順式作用元件SP-1結(jié)合位點。
【圖文】：

搖動培養(yǎng)瓶使消化液流遍所有細胞表面，密切觀察，消化約 1-2min 后，0%的細胞已變圓時吸棄消化液后加入 8ml 培養(yǎng)液以終止消化，，用吸管吸吹打瓶壁上的細胞，反復多次至約 90%以上的細胞已脫落，分吸至兩個管中離心后棄上清，在細胞沉淀中加入 2ml 培養(yǎng)液再吹打細胞使其均勻吸至兩個培養(yǎng)瓶中并加入 8ml 培養(yǎng)液，放入 CO2 培養(yǎng)箱前再次輕輕搖動換液一次，之后再 48-72h 換液一次，細胞 2-3 天生長至融合，傳代培養(yǎng)于實驗。 實驗分組下圖：

Figure 1-3 Agarose electrophoresis of tatal R圖 1-3 從 A549 細胞提取的總R 半定量測定 A549 細胞中 MUC5AC mT-PCR 擴增后，1％凝膠瓊脂糖電泳結(jié)果有一條清晰的 DNA 帶，與預期 MUC5A顯 MUC5AC 基因片段出現(xiàn)。在 510bp 左DH 的編碼基因大小一致，無非特異性電M 1 2 3 4 5 628S18S5S
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R562

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本文編號：2684573