發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 09:29

【摘要】：研究背景臨床危重癥患者因病情重、病種多和免疫力低導(dǎo)致患者合并感染的發(fā)生率很高,又因臥床、有創(chuàng)機(jī)械通氣等原因使得危重患者發(fā)生肺部感染的情況最為多見(jiàn)。通常對(duì)于危重患者較之普通患者的抗感染策略更全面、更強(qiáng)化也更為復(fù)雜,抗菌藥物的選擇及停用對(duì)于臨床醫(yī)生經(jīng)常是比較棘手的問(wèn)題,抗感染治療后肺部感染的再發(fā)也是一大難題。論文前期對(duì)肺部感染再發(fā)的危險(xiǎn)因素開(kāi)展了臨床研究,所獲結(jié)果不僅對(duì)于醫(yī)生做出更合理的抗感染臨床決策有指導(dǎo)意義,還啟發(fā)了從患者宿主防御角度開(kāi)展危重肺病基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的思路。肺表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的磷脂-蛋白混合物,肺表面活性蛋白(SP)是肺表面活性物質(zhì)的重要組分,其中SP-D不僅對(duì)于降低肺泡表面張力有重要作用,SP-D同時(shí)也是宿主防衛(wèi)蛋白,在肺的天然免疫中發(fā)揮重要作用。論文從SP-D基因缺陷小鼠動(dòng)物模型入手,研究肺的病理狀態(tài)和免疫改變,并對(duì)SP-D基因缺陷小鼠進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體干預(yù),探索能否為危重肺病提供肺修復(fù)的可能。研究目的1、通過(guò)SP-D基因缺陷小鼠模型,對(duì)肺組織病理學(xué)、肺內(nèi)炎癥小體、血清炎癥因子和肺泡巨噬細(xì)胞等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。2、探索能否應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體來(lái)修復(fù)因SP-D基因缺陷所致的肺部病理及免疫改變。研究方法1、選擇相同遺傳背景(C57BL/6)的WT小鼠與SP-D KO小鼠為動(dòng)物模型基礎(chǔ),將生長(zhǎng)到6個(gè)月齡以上的SP-D KO小鼠作為主要研究對(duì)象。2、準(zhǔn)備間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體用以治療動(dòng)物模型,首先對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及傳代篩選,然后采用試劑盒法從間充質(zhì)干細(xì)胞提取外泌體,并對(duì)提取的外泌體進(jìn)行蛋白定量及透射電鏡檢測(cè)。3、應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體干預(yù)SP-D KO小鼠,采用經(jīng)鼻給藥途徑對(duì)小鼠進(jìn)行不同劑量療程的外泌體治療,對(duì)經(jīng)外泌體治療的小鼠和未經(jīng)治療的小鼠進(jìn)行分組,并根據(jù)研究需要對(duì)經(jīng)過(guò)治療的小鼠進(jìn)一步分為不同治療劑量的亞組。4、對(duì)各組小鼠分別給予留取下腔靜脈血,進(jìn)行肺泡灌洗或留取肺組織。5、對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HE染色研究肺的組織病理學(xué),比較經(jīng)外泌體治療的和未經(jīng)治療的小鼠肺的組織病理學(xué)改變。6、通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)不同組別小鼠肺內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化情況,同樣的免疫熒光法檢測(cè)不同組別小鼠肺內(nèi)p-NF-κB p65的表達(dá)情況。7、ELISA法檢測(cè)不同組別小鼠血清中炎癥因子IL-6和IL-1β的表達(dá)情況。8、對(duì)肺泡灌洗液進(jìn)行炎癥細(xì)胞學(xué)研究,并嘗試對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外的吞噬實(shí)驗(yàn)。9、應(yīng)用SigmaStat軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)或ANOVA,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1、小鼠的肺組織經(jīng)過(guò)HE染色后,WT小鼠顯示正常肺組織表現(xiàn),6個(gè)月齡以上的SP-D KO小鼠顯示出重度的肺氣腫表現(xiàn),外泌體治療后的SP-D KO小鼠為輕度肺氣腫表現(xiàn)。經(jīng)過(guò)測(cè)量肺泡直徑并進(jìn)行統(tǒng)計(jì),與未治療組小鼠相比較,治療組小鼠的單個(gè)獨(dú)立肺泡直徑較小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、免疫熒光法檢測(cè)肺內(nèi)NLRP3炎癥小體的結(jié)果顯示,與WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺內(nèi)NLRP3的表達(dá)上調(diào),然后將不同外泌體劑量的治療亞組分別與未治療組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)隨著治療劑量增加到3個(gè)劑量和4個(gè)劑量,NLRP3的表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)(P0.05)。3、免疫熒光法檢測(cè)肺內(nèi)p-NF-κB p65的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺內(nèi)p-NF-KB p65的表達(dá)上調(diào),然后將不同外泌體劑量的治療亞組分別與未治療組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)隨著治療劑量增加到3個(gè)劑量和4個(gè)劑量,p-NF-κB p65的表達(dá)有明顯的下調(diào)趨勢(shì)(P0.01)。4、ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清IL-6和IL-1β的結(jié)果顯示,WT組、SP-D KO治療組和SP-D KO未治療組的炎癥因子表達(dá)量都處在較低水平。5、肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)外泌體治療和未經(jīng)過(guò)治療的SP-D KO小鼠肺泡灌洗液中均以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主,對(duì)每種炎癥細(xì)胞的構(gòu)成比進(jìn)行組間比較,未見(jiàn)顯著差異。肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌現(xiàn)象。研究結(jié)論1、6個(gè)月齡以上的SP-D KO小鼠肺組織出現(xiàn)重度肺氣腫表現(xiàn),表明SP-D具有對(duì)肺泡的維持穩(wěn)態(tài)作用。2、SP-D KO小鼠肺內(nèi)NLRP3炎癥小體和p-NF-κB p65均表達(dá)上調(diào),表明SP-D對(duì)肺NLRP3炎癥小體和NF-κB信號(hào)通路的激活有抑制作用。3、經(jīng)MSC外泌體治療的SP-D KO小鼠肺組織為輕度肺氣腫表現(xiàn),表明MSC外泌體可在一定程度上修復(fù)SP-D基因缺陷小鼠的重度肺氣腫病理狀態(tài)。4、增加MSC外泌體治療劑量,可以抑制SP-D KO小鼠肺NLRP3炎癥小體和NF-κB信號(hào)通路的激活。表明MSC外泌體干預(yù)可對(duì)SP-D基因缺陷小鼠肺的免疫改變起到某種程度的修復(fù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R563

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