本文關鍵詞：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘氣道炎癥中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景支氣管哮喘(簡稱哮喘)是全球范圍內(nèi)常見的慢性呼吸道疾病,近年來在世界各國均有逐年上升的趨勢,已成為嚴重威脅人類健康的一類疾病。據(jù)統(tǒng)計,全球約有3億哮喘患者,全球患病率1%-18%,我國約有1000～3000萬哮喘患者,并有不斷增加的趨勢。哮喘是一種由基因與環(huán)境因素共同導致的復雜疾病。盡管哮喘基礎研究已取得較大的進步,但目前發(fā)病機制和發(fā)展環(huán)節(jié)尚未完全明確,臨床上對于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療亦不是很滿意。因此,探討哮喘氣道炎癥發(fā)病機制、尋找新的治療或預防靶點是呼吸系統(tǒng)疾病研究重點和熱點。 支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道重塑及氣道反應性增高為主要特征的免疫變態(tài)反應性疾病。其中,氣道炎癥為最主要的病理變化,并決定氣道阻塞和氣道高反應性的程度。隨著研究的不斷拓展和深入,關于哮喘發(fā)病機制的假說不斷增多,得到最廣泛關注的是哮喘發(fā)病的“衛(wèi)生學假說”,其核心為Th1/Th2失衡。該學說認為哮喘的發(fā)生是由于體內(nèi)Th1/Th2平衡失調所致,即正常人以Th1/Th2保持平衡,但哮喘患者體內(nèi)則Th0向Th2分化過度,使Th2占優(yōu)勢。Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎,Yh2優(yōu)勢是過敏性哮喘形成及進展的關鍵性機制。除了炎癥細胞和炎癥介質,氣道結構細胞特別是氣道上皮細胞也參與氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展,氣道上皮細胞(HBE)首先作為氣道的第一道防線抵抗外來侵害,同時在氣道固有免疫中也發(fā)揮著重要作用。研究證明HBE是哮喘聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的橋梁。隨著對炎癥性疾病的深入研究以及對炎癥通路的逐步了解,炎癥復合體(inflammasome)成為多種炎癥性疾病的研究重點,其中研究最多的就是NLRP3炎癥復合體。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎癥復合體是由NLRP3蛋白、凋亡相關點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和Caspase-1組成的多蛋白復合體。NLRP3蛋白能通過ASC接合半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體pro-Caspase-1(45KDa)組裝成NLRP3炎癥復合體,組裝后的pro-Caspase-1能自動激活形成有活性的Caspase-1,活化的Caspase-1(10KDa和20KDa)促進IL-1家族細胞因子(IL-1β, IL-18, IL-33等)成熟與分泌,從而參與炎癥反應。 為了揭示NLRP3炎癥復合體組裝后激活的Caspase-1在哮喘氣道炎癥的作用機制,本研究選擇了C57BL/6小鼠和人氣道上皮細胞(16HBE)作為研究對象,觀察在哮喘小鼠模型以及人氣道上皮細胞炎癥微環(huán)境中Caspase-1的表達,以及下游細胞因子IL-1家族細胞因子的生成,并通過Ac-YVAD-cmk阻斷Caspase-1活化觀察其是否可以引起IL-1家族細胞因子表達的改變,從而為完善哮喘氣道炎癥機制研究及治療方法上提供參考。 第一部分小鼠哮喘模型建立 目的建立OVA致敏和激發(fā)雌性C57BL/6小鼠哮喘模型。 方法SPF級雌性C57BL/6小鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心)18只,6-8周,體重18-20g,隨機分為3組,對照組(A組)、哮喘組(B組)和Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)組(C組),B、C組小鼠于實驗流程第0天、7天、14天給予腹腔注射雞卵蛋白(OVA)液200μ1致敏,A組僅用生理鹽水替代致敏。B、C組小鼠于第21-27天霧化激發(fā),給予2%OVA40ml,經(jīng)超聲霧化器霧化吸入30min,1次/天；C組每次激發(fā)前30min給予Ac-YVAD-cmk溶液5μg/g腹腔注射；對照組用生理鹽水代替OVA霧化激發(fā)。末次激發(fā)24h后,各組小鼠霧化吸入乙酰甲膽堿,用BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄氣道反應性監(jiān)測指標增強呼氣間歇(Penh)值。第29天采用水合氯醛麻醉小鼠,摘眼球放血處死,75%酒精消毒,行支氣管肺泡灌洗術,回收BALF,離心取細胞沉渣,重懸充板行細胞計數(shù)；涂片,瑞氏染色,細胞分類計數(shù)；取右上肺組織4%多聚甲醛固定,酒精脫水,石蠟包埋,常規(guī)HE染色,光學顯微鏡下觀察組織形態(tài),氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤情況。 結果 1.致敏、激發(fā)哮喘過程小鼠行為學觀察：B組、C組誘發(fā)哮喘后后出現(xiàn)不同程度呼吸急促、立毛、前肢搔鼻和煩躁不安,然后出現(xiàn)口唇紫紺、呼吸急促、二便失禁、活動度減低等癥狀,而A組未見上述癥狀。 2.無創(chuàng)肺功能檢測氣道反應性結果：當乙酰甲膽堿濃度為3.125g/L12.5g/L、25g/L和50g/L時,各組Penh值比較,B組明顯高于A組和C組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。 3. BALF中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分比：①BALF細胞計數(shù)：B組BALF細胞總數(shù)(28.43±3.45)×104/m1,高于A組(9.01±2.33)×104/ml和C組(22.89±4.61)×104/ml (F=46.682, P=0.000)。②BALF嗜酸性粒細胞百分數(shù)：B組嗜酸性粒細胞百分比為(22.35±4.91)%,明顯高于A組(1.07±0.20)%和C組(13.58±2.13)%(F=71.916,P=0.000)。③BALF淋巴細胞百分數(shù)：B組淋巴細胞百分比為(32.32±6.12)%,明顯高于A組(10.76±2.02)%和C組(18.50±3.18)%(F=34.688,P=0.000)。 4.肺組織病理學觀察：A組小鼠肺組織細支氣管和肺泡結構清晰,未見明顯炎癥浸潤；B組小鼠細支氣管壁和周圍有大量炎癥細胞浸潤,主要為淋巴細胞,支氣管腔內(nèi)可見粘液分泌,C組小鼠細支氣管壁和周圍可見炎癥細胞浸潤,杯狀細胞增生,但與哮喘組相比,支氣管和血管周圍炎癥明顯減輕。 結論雌性C57BL/6小鼠OVA聯(lián)合鋁劑腹腔注射致敏后,再用OVA霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型,出現(xiàn)哮喘癥狀和氣道反應性增加,符合哮喘氣道炎癥的病理生理改變。 第二部分哮喘小鼠肺部Caspase-1表達和IL-1β、IL-33生成 目的觀察哮喘小鼠肺部Caspase-1表達和下游細胞因子IL-1β、IL-33的成熟與分泌,探討可能的機制。 方法取3組動物肺組織標本各3份,1份采用Trizol試劑提取總RNA,逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA),以此為模板行PCR擴增。采用實時熒光定量PCR (real time quantitative-PCR)檢測Caspase-1mRNA表達水平；1份加預冷的含蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解液,冰磨3-5min,離心取上清,BCA法測定蛋白含量,繪制標準曲線,計算蛋白濃度,SDS-PAGE電泳和免疫印記反應,半干法轉膜,顯色,曝光,Image J軟件分析；1份用預冷的PBS沖洗后濾紙吸干,稱重,剪刀剪碎后,加入PBS液,冰磨2min,離心取上清,BCA法測定蛋白含量,參照試劑盒說明書進行IL-1β、IL-33的檢測。 結果 1.小鼠肺組織中Caspase-1mRNA的表達：每個樣本的Caspase-1的相對mRNA表達水平直接用樣品各自管家基因GAPDH的表達來標準化初始mRNA量。以2-△△Ct值比較,A組(2.12±1.33)和C組(5.99±4.20)均低于B組(15.97±8.67),差異有統(tǒng)計學意義。(F=10.653,P=0.004)。 2.小鼠肺組織Caspase-1蛋白的表達：通過Image J軟件分析B組Caspase-1/β-actin (0.56±0.03)較A組(0.47±0.03)和C組(0.28±0.03)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(F=73.916,P=0.000) 3.IL-1p和IL-33的分泌：B組肺組織勻漿上清IL-1β (76.49±9.43) pg/mg及IL-33(73.08±6.67) pg/mg含量均高于A組[(37.51±9.13)pg/mg, P0.05;(32.79±5.92)pg/mg, P0.05)和C組[(64.74±8.65)pg/mg, P0.05;(46.94±2.38)pg/mg, P0.05)。 結論 Caspase-1活化及其下游IL-1家族細胞因子(IL-1β, IL-33)增加并參與哮喘氣道炎癥。 第三部分脂多糖誘導人氣道上皮細胞Caspase-1表達研究 目的觀察LPS誘導人氣道上皮細胞過程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表達情況。 方法16HBE細胞復蘇后以RPMI-1640(含10%胎牛血清)為基本培養(yǎng)液,0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代,每周傳代2-3次。2×105/ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后貼壁,用PBS液和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基清洗,37-℃,5%C02培養(yǎng)箱中無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),用LPS(10μg/ml)預先將16HBE細胞致敏,制備氣道上皮細胞哮喘模型,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,PBS液為空白對照,LPS組加LPS (10μg/ml)培養(yǎng)24h；LPS+組Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)(以下簡稱LPS+cmk組)先用Ac-YVAD-cmk (10μmol/L)預處理,1h后再加入LPS(10μg/ml)培養(yǎng)至24h。四氮唑鹽(MTT)法測定各組細胞增殖能力,RT-PCR檢查各組細胞Caspase-1mRNA的表達,western blot檢測各組細胞Caspase-1蛋白表達,ELISA檢測各組細胞上清液中IL-1β的生成。 結果 1.MTT檢測及OD值測定：三組人氣道上皮細胞MTT檢測及OD值測定。陰性對照組OD值為0.57±0.10,LPS組OD值為0.54±0.06,LPS+cmk組OD值為0.51±0.08,各組OD值比較P0.05(P=0.611,F=0.520),各組細胞增殖無顯著差異。 2.各組細胞Caspase-1mRNA的表達：以2的-△△Ct次方比較,對照組(1.33±0.33)和LPS+cmk組(1.50±0.24)均低于LPS組(3.11±0.57),各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=17.564,P=0.003)。 3.各組細胞Caspase-1蛋白的表達：以灰度掃描結果(Z值)比較,LPS組為0.85±0.11,LPS+cmk組為0.48±0.06,對照組為0.24±0.03。LPS+cmk組與對照組Z值均小于LPS組,差異有統(tǒng)計學意義(F=55.158,P=0.000)。 4.各組細胞上清液IL-1β含量變化：與LPS組[(52.34±2.47) pg/ml]相比,陰性對照組[(15.73±6.83)pg/ml]和LPS+cmk組[(38.15±5.97)pg/ml]均降低,三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=46.208P=0.000)。 結論Caspase-1活化參與LPS致人氣道上皮細胞炎癥過程,并促進下游IL-1p的生成。
【關鍵詞】：小鼠 哮喘 OVA 肺功能 哮喘 Caspase-1 IL-1β IL-33 人氣道上皮細胞 Caspase-1 脂多糖IL-1β
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 參考文獻18-21
• 第一部分 小鼠哮喘模型建立21-30
• 1. 材料與方法21-25
• 2. 結果25-27
• 3. 討論27-29
• 參考文獻29-30
• 第二部分 哮喘小鼠肺部Caspase-1表達和L-1β、IL-33的生成30-49
• 1. 材料與方法31-44
• 2. 實驗結果44-46
• 3. 討論46-48
• 參考文獻48-49
• 第三部分 脂多糖誘導的人氣道上皮細胞Caspase-1表達研究49-58
• 1. 材料與方法50-53
• 2. 實驗結果53-55
• 3. 討論55-57
• 參考文獻57-58
• 全文小結58-59
• 綜述59-67
• 參考文獻63-67
• 攻讀學位期間成果67-68
• 致謝68-69

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