【摘要】：目的：采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立大鼠急性肺損傷(actue lung injury,ALI)后肺纖維化模型,了解肺組織骨橋蛋白(osteopontin,OPN)表達(dá)水平以及OPN對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷后肺纖維化肺組織中羥脯氨酸、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p1(TGF-β1)、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平的影響,從而探討OPN在脂多糖致大鼠急性肺損傷后肺纖維化中所處的地位與作用。方法：①將90只清潔級(jí)Wistar雄性健康大鼠,平均體重約150-180g,按隨機(jī)數(shù)字表將動(dòng)物分為正常對(duì)照組(NS組,n=30)、模型組(ALI組,n=30)、干預(yù)組(n=30)。ALI組：于第0、1、2天腹腔注射LPS (5mg.kg-1.d-1,每1mgLPS溶于1ml的無(wú)菌生理鹽水中),在LPS注射5分鐘后腹腔注射生理鹽水(0.5m1)；干預(yù)組：第0、1和2天腹腔注射LPS(5mg.kg-1.d-1),LPS注射5分鐘后腹腔注射骨橋蛋白抗體(Anti-OPN-Ab)(0.5ml.d-1),效價(jià)為1：32)；NS組：第0、1、2天腹腔注射生理鹽水(5ml.kg.d-1),第一次腹腔注射生理鹽水5分鐘后再次腹腔注射生理鹽水(0.5ml.d-1)；各組大鼠分別于4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、7天、14天、28天隨機(jī)處死動(dòng)物各5只留取標(biāo)本。②病理組織HE染色及Masson染色進(jìn)行肺損傷及肺纖維化的評(píng)分。③測(cè)定羥脯氨酸的含量,具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作。④免疫組織化學(xué)測(cè)定肺組織中TGF-β1的表達(dá)。⑤實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction, FQ RT-PCR)檢測(cè)肺組織Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。⑥免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)各組肺組織勻漿中OPN表達(dá)水平,用OPN/p-actin(光密度比值)表示。結(jié)果：①NS組大鼠肺組織小葉結(jié)構(gòu)正常,肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰,肺間質(zhì)無(wú)炎性侵潤(rùn),無(wú)纖維結(jié)締組織增生,肺泡壁正常。ALI組8小時(shí)組可見(jiàn)肺泡壁增厚,肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞及藍(lán)色膠原纖維增多,7天組可見(jiàn)正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔閉陷、融合,由藍(lán)色膠原纖維及炎性細(xì)胞占據(jù)形成纖維化,14天及28天炎癥較前減輕,肺纖維化程度加重；干預(yù)組上述病理表現(xiàn)較ALI組有明顯減輕。②ALI組大鼠肺組織羥脯氨酸含量、TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈進(jìn)行性增加,同一時(shí)間點(diǎn)與NS組相差顯著(P0.05)；干預(yù)組隨時(shí)間增長(zhǎng)表達(dá)也為進(jìn)行性增加,與NS組比較差異有顯著意義(P0.05),但與ALI組比較有明顯下降(P0.05)。③OPN在大鼠肺組織中的表達(dá)：NS組檢測(cè)到OPN少量的表達(dá),而ALI組和干預(yù)組OPN的表達(dá)隨時(shí)間的增加而表達(dá)增多,28天表達(dá)最明顯；進(jìn)一步經(jīng)軟件灰度分析提示,同一時(shí)間點(diǎn)ALI組和干預(yù)組間OPN表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論：①腹腔注射LPS能成功誘導(dǎo)ALI后肺纖維化動(dòng)物模型,8小時(shí)肺損傷最重,28天肺纖維化最明顯。②ALI早期即有OPN、羥脯氨酸、TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)升高,肺纖維化期升高更明顯。③OPN促進(jìn)ALI后肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、羥脯氨酸、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá),從而促進(jìn)ALI后肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

3.肺組織中TGF一pl的表達(dá)水平大鼠肺組織中TGF一田蛋白表達(dá)主要位于肺泡巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色顆粒(見(jiàn)圖27一29)。Ns組

一3.660*109(eone)+42.011，，與對(duì)應(yīng)的GApDH基因兩者的M差值均 >0.1，故后續(xù)選用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。融解曲線分析結(jié)果表明只有一個(gè)特異性峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)(圖31)。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：2664597