【摘要】：急性肺損傷(acute lung injury,ALI)為肺炎及嚴(yán)重膿毒癥等患者常見并發(fā)癥之一,其惡化階段即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),預(yù)后差,病死率高,迄今尚無安全有效的早期干預(yù)藥物,亟待研究進(jìn)一步解決。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是ALI中最為重要的效應(yīng)細(xì)胞受損靶細(xì)胞,也是ALI藥物干預(yù)的重要靶點。課題組前期構(gòu)建了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向的細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)單抗辛伐他汀納米脂質(zhì)載體(ICAM-NLC),具有一定早期ALI抗炎能力,但總體效果不甚理想,有待進(jìn)一步提高。為此,本論文通過納米基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以陽離子魚精蛋白(protamine,Pro)為 DNA 密接材料,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)基因為基因藥物,在前期制備ICAM-NLC納米載體的基礎(chǔ)上,通過靜電吸附法繼續(xù)構(gòu)建ICAM-1單抗辛伐他汀納米脂質(zhì)載體/魚精蛋白/Ang-1基因三元復(fù)合物(ICAM-NLC/Pro/Ang),即Ang-1基因與辛伐他汀納米共傳遞系統(tǒng),將Ang-1基因與辛伐他汀共同靶向輸送至ALI肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,以期通過基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的方式,進(jìn)一步提高ALI的早期干預(yù)能力。采用靜電吸附法構(gòu)建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物,形狀呈類球狀,粒徑隨ICAM-NLC質(zhì)量比例的增高而增大,當(dāng)ICAM-NLC/Pro/Ang質(zhì)量比例增加至30:4:1時,三元復(fù)合物粒徑達(dá)到最大約為351.7nm,Zeta電位為12.1mV。凝膠阻滯試驗表明,當(dāng)ICAM-NLC對DNA的比例在10到30之間時,三元復(fù)合物中的DNA均可以被完全阻滯,體現(xiàn)了所制備的三元復(fù)合物對Ang-1基因的良好保護(hù)作用。MTT法細(xì)胞毒性試驗結(jié)果顯示,三元復(fù)合物與EAhy926細(xì)胞共同孵育48h后,細(xì)胞存活率高達(dá)90%以上,表明三元復(fù)合物較低的細(xì)胞毒性,是潛在的ALI基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的納米載藥系統(tǒng)。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926細(xì)胞24h,構(gòu)建ALI血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。研究結(jié)果顯示,與正常EAhy926細(xì)胞相比,經(jīng)LPS活化后,流式細(xì)胞儀所檢測到的表達(dá)ICAM-1粘附分子的細(xì)胞比例從17.2%提高至50.0%,說明成功構(gòu)建ALI血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。用標(biāo)記了羅丹明(ROX)染料的DNA代替目的基因Ang-1,制備ROX標(biāo)記的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物在EAhy926細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。細(xì)胞攝取研究表明,隨著ICAM-NLC比例提高,三元復(fù)合物的細(xì)胞攝取程度降低,考慮與三元復(fù)合物的粒徑增大有關(guān);與非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,經(jīng)ICAM-1單抗修飾的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA 三元復(fù) 合物細(xì) 胞轉(zhuǎn)運 能力明 顯提升,表明 ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元復(fù)合物對LPS活化后的EAhy926經(jīng)ICAM-1單抗介導(dǎo)的細(xì)胞靶向特性。制備ROX和異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的ICAM-NLC/Pro/DNA三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物中基因(ROX標(biāo)記)與NLC(FITC標(biāo)記)的細(xì)胞攝取共定位,結(jié)果表明三元復(fù)合物與EAhy926細(xì)胞孵育6h后,NLC主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,而DNA則部分轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核,說明以NLC為基礎(chǔ)的納米給藥系統(tǒng)具有潛在的DNA核導(dǎo)入能力。以ICAM-1單抗阻斷細(xì)胞表面的ICAM-1粘附分子后,流式細(xì)胞儀定量檢測顯示,攝取ICAM-NLC/Pro/DNA(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物的EAhy926細(xì)胞樣本MFIs從32降低到了 23,表明經(jīng)細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制是三元復(fù)合物細(xì)胞轉(zhuǎn)運的主要途徑之一。采用DiR熒光染料標(biāo)記ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物,以LPS誘導(dǎo)構(gòu)建ALI Balb/c小鼠模型,三元復(fù)合物尾靜脈注射給藥6h后,小鼠體內(nèi)分布顯示肺臟熒光強(qiáng)度最強(qiáng),證實了 ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物的肺組織靶向特征。以綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP為報告基因(EGFP)替代Ang-1基因,制備綠色熒光蛋白標(biāo)記的ICAM-NLC/Pro/EGFP三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物在EAhy926模型細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率;研究結(jié)果顯示:三元復(fù)合物在EAhy926模型細(xì)胞內(nèi)均具有較強(qiáng)的綠色熒光蛋白表達(dá)能力(20%以上);隨著ICAM-NLC與DNA的重量比從10/1增加到30/1,三元復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率呈輕微下降趨勢,這可能與NLC比例較高的三元復(fù)合物粒徑較大,從而更難被細(xì)胞攝取有關(guān);與非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,ICAM-NLC/Pro/EGFP組的基因轉(zhuǎn)染效率顯著提高。考慮到辛伐他汀給藥劑量及粒徑較大納米粒利于肺組織靶向的需要,選擇ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)作為后續(xù)Ang-1蛋白表達(dá)及動物藥效學(xué)研究。以Western Blot法測定三元復(fù)合物在ALI模型細(xì)胞及模型動物的Ang-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:與EAhy926細(xì)胞孵育48h后,ICAM-NLC/Pro/Ang組細(xì)胞內(nèi)Ang-1蛋白表達(dá)含量顯著高于靜息細(xì)胞組、LPS活化細(xì)胞組以及ICAM-NLC細(xì)胞組(P0.001);而ICAM-NLC/Pro/Ang組Ang-1蛋白表達(dá)又顯著高于非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組(P0.05),可能是基于ICAM-NLC/Pro/Ang對高表達(dá)ICAM-1 EAhy926細(xì)胞的靶向性。ALI模型小鼠給予ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物48h后,肺組織Ang-1蛋白的表達(dá)趨勢與EAhy926細(xì)胞的表達(dá)趨勢基本一致。表明ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物具有提高ALI模型細(xì)胞以及模型小鼠中Ang-1蛋白表達(dá)水平的作用,具有潛在的改善ALI血管內(nèi)皮損傷的作用。選擇Balb/c小鼠,氣管滴注LPS構(gòu)建ALI小鼠模型,進(jìn)行三元復(fù)合物對ALI小鼠模型保護(hù)作用的藥效學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn),ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)給藥24h、48h后,與ICAM-NLC組、非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,具有顯著改善小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎癥因子水平、炎癥細(xì)胞總計數(shù)以及多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)占BALF中總細(xì)胞比例的作用,并且48h的炎癥因子水平及炎癥細(xì)胞水平與24h較為相似;HE染色組織病理切片也提示,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)對ALI模型小鼠病理肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡隔增厚等病理表征均具有最顯著的改善作用。上述結(jié)果表明,本研究所構(gòu)建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物,即Ang-1基因與辛伐他汀納米共傳遞系統(tǒng),可有效將Ang-1基因與辛伐他汀共同靶向輸送至ALI肺組織,通過基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的方式,可改善ALI早期的炎癥水平,進(jìn)一步提高了 ALI的早期干預(yù)能力,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
【圖文】：

１．３結(jié)果與討論逡逑１．３．１邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物的制備逡逑采用靜電吸附法制備ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物。如圖１．１所示，帶陰離逡逑９逡逑

ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑１＿３．５邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物細(xì)胞毒性評價逡逑采用ＭＴＴ法考察三元復(fù)合物的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖１．５。ＭＴＴ結(jié)果表明，逡逑ＥＡｈｙ９２６邋細(xì)胞與邋Ａｎｇ／Ｐｒｏ、ＩｇＧ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ、ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ邋共同孵育邋４８逡逑ｈ后，不同質(zhì)量比例的ＩｇＧ－ＮＬＣ／邋Ｐｒｏ／Ａｎｇ及ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元復(fù)合物細(xì)胞逡逑存活率均大于９０％；而孵育Ａｎｇ／ＰＥＩ２５Ｋ４８ｈ后，細(xì)胞存活率約６０％，細(xì)胞存活率逡逑較低，體現(xiàn)本研究中ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元復(fù)合物納米載體對模型細(xì)胞具有較逡逑高的安全性，可作為潛在的ＡＬＩ基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合的納米給藥系統(tǒng)載體。逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R563

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本文編號：2661006