【摘要】： 為研究G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)參與急性肺損傷(ALI)發(fā)生的機(jī)制，本課題在用大腸桿菌脂多糖(LPS)建立內(nèi)毒素性ALI大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用Western blot觀察了內(nèi)毒素性ALI大鼠肺組織GRK2、GRK3在蛋白水平表達(dá)的變化和山莨菪堿的干預(yù)作用。本課題還在體外成功分離、培養(yǎng)了大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)的基礎(chǔ)上，采用Western blot分別觀察了LPS、TNFα作用后PMVEC中GRK2、GRK3在蛋白水平表達(dá)的改變和山莨菪堿的干預(yù)作用；用RT-PCR法觀察了LPS作用后大鼠PMVEC中GRK2、GRK3、β-arrestin1和β-arresti2在mRNA水平表達(dá)的改變和山莨菪堿的干預(yù)作用；分別用fura-2/AM和放射免疫法觀察了LPS、TNFα作用后PMVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)、cAMP改變和山莨菪堿的干預(yù)作用。本研究結(jié)合我們既往的工作主要探討：(1)內(nèi)毒素性ALI大鼠肺組織GRKs變化與β-腎上腺素能受體(AR)下調(diào)之間的關(guān)系；(2)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC GRKs、β-arrestins變化與β-AR下調(diào)之間的關(guān)系；(3)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC [Ca2+]i 、cAMP變化與β-AR下調(diào)及肺微血管內(nèi)皮損傷之間的關(guān)系。 結(jié)果：(1)Western blot檢測(cè)大鼠肺組織GRK2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，LPS組、LPS+山莨菪堿組雜交帶GRK2含量顯著增高；LPS組與LPS+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量比較無顯著差異。Western blot檢測(cè)大鼠肺組織GRK3蛋白表達(dá)，結(jié)果重復(fù)3次均為陰性。(2)Western blot檢測(cè)大鼠PMVEC GRK2蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較LPS組和LPS+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量顯著增高； TNF(組和TNF(+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量也較正常對(duì)照組顯著增高。Western blot檢測(cè)大鼠PMVEC GRK3表達(dá)，結(jié)果重復(fù)3次均為陰性。SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大鼠PMVEC蛋白裂解液電泳結(jié)果缺乏GRK5、GRK5蛋白帶。(3)RT-PCR檢測(cè)大鼠PMVEC GRK2 mRNA表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組和LPS+山莨菪堿組GRK2 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高；LPS組、LPS+山莨菪堿組和正常對(duì)照組均未檢測(cè)到有GRK3 mRNA表達(dá)。(4)RT-PCR檢測(cè)大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LPS組和LPS+山莨菪堿組β-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增高。(5)與正常對(duì)照組比較，，LPS組和LPS+山莨菪堿組15min和90min兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠PMVEC WP=7 [Ca2+]i均顯著升高； TNFα組和TNFα+山莨菪堿組15min和90min兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)[Ca2+]i也較正常對(duì)照組顯著升高。(6)正常大鼠PMVEC細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度為0.473±0.054μμmol /40μl。LPS組和LPS+山莨菪堿組15min、90min兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠PMVEC細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度顯著高于正常對(duì)照組。TNFα組和TNFα+山莨菪堿組，15min和 90min兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度也顯著高于正常對(duì)照組。 結(jié)論：(1)大鼠肺組織表達(dá)GRK2，但不表達(dá)GRK3。(2)大鼠PMVEC表達(dá)GRK2，但不表達(dá)GRK3、GRK5和GRK6。(3)內(nèi)毒素性肺損傷大鼠肺組織GRK2表達(dá)增高，可能是導(dǎo)致內(nèi)毒素性肺損傷大鼠肺組織β-受體內(nèi)化和失敏的主要原因之一。(4)LPS可誘導(dǎo)大鼠PMVEC GRK2在mRNA和蛋白水平表達(dá)增高；TNFα可誘導(dǎo)大鼠PMVEC GRK2在蛋白水平表達(dá)增高。GRK2表達(dá)增高可能是LPS和TNFα作用后大鼠PMVEC β-受體內(nèi)化，并表現(xiàn)為受體下調(diào)的主要原因之一。(5)LPS可誘導(dǎo)大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達(dá)增高，這可能也是LPS作用后促使大鼠PMVECβ-受體內(nèi)化，并表現(xiàn)為受體下調(diào)的主要原因之一。(6)LPS和TNFα作用后大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i濃度和cAMP濃度升高的機(jī)制可能與β-受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2657586