【摘要】： 為研究G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)參與急性肺損傷(ALI)發(fā)生的機制，本課題在用大腸桿菌脂多糖(LPS)建立內毒素性ALI大鼠模型的基礎上，采用Western blot觀察了內毒素性ALI大鼠肺組織GRK2、GRK3在蛋白水平表達的變化和山莨菪堿的干預作用。本課題還在體外成功分離、培養(yǎng)了大鼠肺微血管內皮細胞(PMVEC)的基礎上，采用Western blot分別觀察了LPS、TNFα作用后PMVEC中GRK2、GRK3在蛋白水平表達的改變和山莨菪堿的干預作用；用RT-PCR法觀察了LPS作用后大鼠PMVEC中GRK2、GRK3、β-arrestin1和β-arresti2在mRNA水平表達的改變和山莨菪堿的干預作用；分別用fura-2/AM和放射免疫法觀察了LPS、TNFα作用后PMVEC細胞內鈣離子([Ca2+]i)、cAMP改變和山莨菪堿的干預作用。本研究結合我們既往的工作主要探討：(1)內毒素性ALI大鼠肺組織GRKs變化與β-腎上腺素能受體(AR)下調之間的關系；(2)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC GRKs、β-arrestins變化與β-AR下調之間的關系；(3)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC [Ca2+]i 、cAMP變化與β-AR下調及肺微血管內皮損傷之間的關系。 結果：(1)Western blot檢測大鼠肺組織GRK2蛋白表達發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，LPS組、LPS+山莨菪堿組雜交帶GRK2含量顯著增高；LPS組與LPS+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量比較無顯著差異。Western blot檢測大鼠肺組織GRK3蛋白表達，結果重復3次均為陰性。(2)Western blot檢測大鼠PMVEC GRK2蛋白表達結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較LPS組和LPS+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量顯著增高； TNF(組和TNF(+山莨菪堿組雜交帶的GRK2含量也較正常對照組顯著增高。Western blot檢測大鼠PMVEC GRK3表達，結果重復3次均為陰性。SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大鼠PMVEC蛋白裂解液電泳結果缺乏GRK5、GRK5蛋白帶。(3)RT-PCR檢測大鼠PMVEC GRK2 mRNA表達結果發(fā)現(xiàn)，LPS組和LPS+山莨菪堿組GRK2 mRNA表達較正常對照組顯著增高；LPS組、LPS+山莨菪堿組和正常對照組均未檢測到有GRK3 mRNA表達。(4)RT-PCR檢測大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達結果發(fā)現(xiàn)， LPS組和LPS+山莨菪堿組β-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達均較正常對照組顯著增高。(5)與正常對照組比較，，LPS組和LPS+山莨菪堿組15min和90min兩個時相點大鼠PMVEC WP=7 [Ca2+]i均顯著升高； TNFα組和TNFα+山莨菪堿組15min和90min兩個時相點[Ca2+]i也較正常對照組顯著升高。(6)正常大鼠PMVEC細胞內cAMP濃度為0.473±0.054μμmol /40μl。LPS組和LPS+山莨菪堿組15min、90min兩個時相點大鼠PMVEC細胞內cAMP濃度顯著高于正常對照組。TNFα組和TNFα+山莨菪堿組，15min和 90min兩個時相點細胞內cAMP濃度也顯著高于正常對照組。 結論：(1)大鼠肺組織表達GRK2，但不表達GRK3。(2)大鼠PMVEC表達GRK2，但不表達GRK3、GRK5和GRK6。(3)內毒素性肺損傷大鼠肺組織GRK2表達增高，可能是導致內毒素性肺損傷大鼠肺組織β-受體內化和失敏的主要原因之一。(4)LPS可誘導大鼠PMVEC GRK2在mRNA和蛋白水平表達增高；TNFα可誘導大鼠PMVEC GRK2在蛋白水平表達增高。GRK2表達增高可能是LPS和TNFα作用后大鼠PMVEC β-受體內化，并表現(xiàn)為受體下調的主要原因之一。(5)LPS可誘導大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表達增高，這可能也是LPS作用后促使大鼠PMVECβ-受體內化，并表現(xiàn)為受體下調的主要原因之一。(6)LPS和TNFα作用后大鼠肺微血管內皮細胞[Ca2+]i濃度和cAMP濃度升高的機制可能與β-受體介導的信號轉導通路無關。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R563

【參考文獻】

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本文編號：2657586