【摘要】：1.研究背景與目的 急性肺損傷／急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是臨床較為常見的危重癥,由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭。其主要病理特征為由于肺微血管通透性增高,肺泡滲出富含蛋白質(zhì)的液體,進而導致肺水腫及透明膜形成,可伴有肺間質(zhì)纖維化。病理生理改變以肺容積減少、肺順應性降低和嚴重通氣／血流比例失調(diào)為主。臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥,肺部影像學表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變。盡管采取強有力的重癥監(jiān)護措施,死亡率仍達30-50%。 近年來的研究表明存在肺水形成和吸收動態(tài)平衡機制：ALI/ARDS肺水形成是由于肺血管通透性增加,導至水腫液形成并積聚在肺間質(zhì)和肺泡腔。肺水吸收主要依靠存在于肺泡Ⅰ型(ATⅠ)和Ⅱ型上皮細胞(ATⅡ)的鈉水轉(zhuǎn)運系統(tǒng),主要由上皮鈉通道(ENaC)、環(huán)核甘酸門控的陽離子通道(CNG)、水通道(AQP)和Na+-K+-ATP酶等組成。肺泡腔內(nèi)液體的吸收,一般先是水腫液中的Na+通過肺泡上皮細胞頂膜的ENaC、CNG進入細胞內(nèi),再經(jīng)上皮細胞基底外側(cè)的Na+-K+-ATP酶進入肺間質(zhì)。肺泡腔內(nèi)的液體則由Na+轉(zhuǎn)運后造成的滲透壓梯度驅(qū)動,或通過AQP進入肺間質(zhì)而后吸收入血液循環(huán)。 肺泡上皮液體重吸收與滲出平衡,就能建立一個穩(wěn)定的狀態(tài),為ALI/ARDS的恢復爭取時間。Ware等的臨床研究顯示大多數(shù)肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運功能受到損傷的通透性肺水腫和肺損傷病人,有著更長的呼吸衰竭期和更高的死亡率；相反,少數(shù)肺泡水腫液較快清除的病人有著更高的生存率。 臨床證據(jù)表明,ALI/ARDS狀態(tài)下肺水清除明顯下降,主要是由于肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運功能受到損傷引起的,但具體機制還有待闡明。ALI/ARDS時肺組織細胞出現(xiàn)凋亡和壞死,可以破壞一部分鈉水轉(zhuǎn)運系統(tǒng),在未發(fā)生凋亡和壞死細胞上的鈉水轉(zhuǎn)運系統(tǒng)狀態(tài)又是如何呢?在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),ATⅡ在ARDS狀態(tài)下鈉轉(zhuǎn)運功能明顯下降。最近Johnson、Borok等相繼在ATⅠ上也發(fā)現(xiàn)存在ENaC和Na+-K+-ATP酶,并且ATⅠ鈉轉(zhuǎn)運能力是ATⅡ的2.5～3倍。根據(jù)以上事實可以推測,鈉水轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的破壞和功能下降在ARDS肺水腫發(fā)生中可能起重要作用。 在我們前期的研究中觀察到,油酸致ARDS大鼠血管外肺水顯著增加,予以特布他林(Terbutaline, cAMP激動劑)后血管外肺水明顯減少。ARDS大鼠ATⅡ全細胞電流較正常組顯著下降,但仍可觀察到全細胞電流,該電流大部分可被ENaC阻滯劑Amiloride抑制,并且在Terbutaline刺激下全細胞電流明顯增加,不僅超過正常組全細胞電流水平并可達到正常組Terbutaline刺激下的全細胞電流水平。 Lucky Jain等發(fā)現(xiàn),當ATⅡ生長于玻璃平板并浸沒于不含類固醇激素的培養(yǎng)液時,ATⅡ上所表達的鈉通道絕大部分是單位電導約21-pS,鈉、鉀選擇性接近于1的非選擇性陽離子通道(NSC)；而當ATⅡ生長于可滲透性支持物,基底膜浸于培養(yǎng)基,頂膜暴露于空氣中,并且培養(yǎng)基中含有類固醇激素時,ATⅡ上表達的絕大部分是低電導的6.6±3.4pS,高度鈉選擇性的通道(HSC), PNa/PK80,并可被低于微摩爾級濃度的Amiloride阻斷。Xi-Juan Chen等發(fā)現(xiàn)Terbutaline對兩類通道的作用機制也不同：對于NSC, Terbutaline增加NSC開放概率但不改變NSC數(shù)目；對于HSC, Terbutaline增加HSC數(shù)目但不改變開放概率。Johnson等在急性分離ATⅡ上證實了這兩種通道的存在,因此,在ALI/ARDS狀態(tài)下Terbutaline可能不僅增加HSC的數(shù)量,還增加NSC的開放概率來增加ENaC的電流。 然而,Norlin等發(fā)現(xiàn)AFC還受非Amiloride敏感的環(huán)核甘酸門控通道(CNG)的影響。1-cis-Diltiazem(CNG抑制劑)在大鼠正常對照組對肺水清除率(AFC)無影響,提示CNG似乎不參與AFC；然而在Terbutaline組1-cis-Diltiazem卻抑制AFC達50%,與Amiloride作用相當。Kemp等在大鼠ATⅡ進一步研究了該通道,顯示該通道為cGMP調(diào)控的、非Amiloride敏感的、非選擇性的陽離子通道(Na+／K+通透比率為0.73±0.02)。因此,在Terbutaline刺激下,可能還通過增加經(jīng)CNG的Na+流,從而增加AFC。 在ALI/ARDS狀態(tài)下情況更為復雜。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)油酸致ARDS大鼠ATⅡcAMP降低、cGMP升高,血管外肺水增加；應用Terbutaline后cAMP升高,cGMP與油酸組比無明顯變化,血管外肺水明顯減少。這是否意味著(1)在ALI/ARDS狀態(tài)下CNG的Na+流是增加的,應用Terbutaline后該Na+流并未進一步增加,Terbutaline減少ARDS狀態(tài)下血管外肺水并不通過增強CNG功能這條途徑?或(2)在ALI/ARDS狀態(tài)下CNG內(nèi)吞,細胞膜上CNG數(shù)量減少,即使cGMP增加,也不能明顯影響該通道；Terbutaline可以通過增加CNG向膜上轉(zhuǎn)運從而增加細胞膜上CNG數(shù)量來增加CNG通道電流? 本研究擬采用膜片鉗技術(shù),研究ENaC和CNG在ALI/ARDS狀態(tài)下Na+轉(zhuǎn)運中的作用機制,從而進一步完善對ALI/ARDS病理生理機制的認識。 2.研究方法 選用健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠,體質(zhì)量180-220g。采用油酸0.1 ml/kg股靜脈注射制備ALI/ARDS模型,血氣分析結(jié)合病理切片進行模型評價。肺泡腔內(nèi)胰酶灌注消化法分離ATⅡ,臺盼藍染色法鑒定細胞活力,堿性磷酸酶染色法鑒定ATⅡ。在膜片鉗全細胞膜式下,應用amiloride(ENaC阻斷劑)和ZnCl2(CNG阻斷劑)觀察正常和ALI/ARDS狀態(tài)下ATⅡ上ENaC和CNG通道電流的變化以及特布他林作用下兩者的反應,從而了解ENaC和CNG的鈉離子轉(zhuǎn)運功能。細胞刺激程序為：鉗制電壓0 mV,予以-100 mV持續(xù)500ms的電刺激并記錄基礎電流后,更換含amiloride 10μM浴液5分鐘后記錄amiloride抑制后電流,最后更換含amiloride 10μM, ZnCl2 1mM浴液5分鐘后記錄amiloride和ZnCl2聯(lián)合抑制后電流。采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。 3.研究結(jié)果 3.1 ALI/ARDS模型 大鼠股靜脈注射油酸后,2min內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促,多數(shù)在30min后有嘆氣樣呼吸,胸腹矛盾運動,氣管插管內(nèi)有紅色分泌物,大鼠口唇部發(fā)紺。油酸肺損傷后PH值由損傷前7.36±0.01降至7.24±0.02(P0.05)；PaO2由12.44±0.23kpa降至6.05±0.45kpa (P0.05); PaO2/FiO2由445.28±8.39降至216.61±16.16(P0.05)；PaCO2由5.45±0.15 kpa升至7.22±0.59(P0.05)。開胸可見肺充血、腫脹,以雙下肺為重,邊緣圓鈍,胸膜緊張發(fā)亮,氣道內(nèi)有泡沫狀血性分泌物。病理切片顯示支氣管周圍可見袖套樣水腫,肺泡等組織形態(tài)欠清晰,肺泡腔內(nèi)紅染,可見紅細胞,肺泡間質(zhì)明顯增寬、水腫,粒細胞顯著增多,局灶性肺不張,壞死。 3.2 ATⅡ的分離和鑒定 ATⅡ經(jīng)AKP染色被染成藍紫色。正常組細胞活力(91.00±2.10)%,純度(57.33±5.05)%；油酸肺損傷組細胞活力(83.50±1.64)%,純度(51.00±4.34)%,細胞活力和純度均比比正常組下降(P0.05) 3.3離子通道電流 ATⅡ全細胞電流可被amiloride和；ZnCl2抑制(P0.01),顯示存在amiloride敏感電流和Zn2+敏感電流；amiloride敏感電流占(39.42±12.36)%,Zn2+敏感電流占(29.70±8.14)%,兩者所占比例無差別(P0.05)。特布他林可增加amiloride敏感電流(主效應F=26.963,P0.001)和Zn2+敏感電流(主效應F=40.786,P0.001)；amiloride敏感電流占(50.87±8.08)%,Zn2+敏感電流占(30.17±7.62)%, amiloride敏感電流所占比例約為Zn2+敏感電流的1.7倍(P0.05) 油酸肺損傷時ATⅡ全細胞電流仍可被amiloride和ZnCl2抑制(P0.01),顯示仍存在amiloride敏感電流和Zn2+敏感電流,但兩者均較正常時下降(主效應F=25.997,P0.001；主效應F=17.870,P0.001),予以特布他林后,兩者均可恢復到正常水平(主效應F=26.963,P0.001；主效應F=40.786,P0.001)。 4.結(jié)論 (1)肺泡腔內(nèi)胰酶消化法可以獲得一定純度的ATⅡ,應用AKP染色鑒定ATⅡ,適用與肺泡巨噬細胞區(qū)別。能用光鏡觀察,操作簡便,染色步驟少,30分鐘內(nèi)可獲得結(jié)果,與其它方法比較,非常簡便有效。 (2)急性分離的ATⅡ上具有功能性ENaC和CNG,并且兩者在Na+轉(zhuǎn)運中起主要作用,但ENaC起更主要的作用；特布他林作用下ENaC和CNGNa+轉(zhuǎn)運均增強,ENaC仍起更主要的作用。 (3)結(jié)合Norlin等的結(jié)果可以推論：正常大鼠ATⅠ上Na+轉(zhuǎn)運以ENaC和CNG為主,但ENaC起更主要的作用；特布他林作用下ENaC和CNGNa+轉(zhuǎn)運均增強,但CNG起更主要作用。 (4)大鼠油酸肺損傷模型是比較好的ALI/ARDS模型。經(jīng)股靜脈注射油酸,與尾靜脈注射相比,注射難度小,劑量準確；與下腔靜脈注射相比,克服了不必要的創(chuàng)傷。油酸用量在0.1 ml/kg,模型成型快,復制成功率高,大鼠出現(xiàn)的癥狀、體征、血氣和病理改變與ALI/ARDS相符。 (5)油酸肺損傷大鼠ATⅡ活力和純度均下降,ATⅡ上ENaC和CNG仍具有Na+轉(zhuǎn)運功能,但其Na+轉(zhuǎn)運功能明顯減弱；在特布他林作用下兩者明顯增強,并可達到正常水平。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R563

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李濤平;申海燕;;油酸肺損傷時肺泡II型細胞鈉轉(zhuǎn)運功能的變化[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年05期

2 何琳;李濤平;朱麗華;;油酸肺損傷時肺泡內(nèi)液體清除和肺泡II型細胞內(nèi)cAMP、cGMP水平的變化[J];南方醫(yī)科大學學報;2008年04期

3 周莉;肺泡Ⅱ型上皮細胞及其分離鑒定與原代培養(yǎng)[J];中國肺癌雜志;2003年03期

4 歐陽瑤,趙鳴武,廖松林;實驗性油酸型呼吸窘迫綜合征肺形態(tài)學的觀察[J];貴州醫(yī)藥;1998年04期

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