【摘要】： 第一部分機械牽張A549細胞對細胞活性和穿透素3表達的影響 研究背景與目的大量資料證實了呼吸機所致肺損傷(VILI)與機械牽張應力有關,推測其可能機制是機械牽張對肺細胞的直接刺激觸發(fā)、激活或啟動細胞的牽張敏感基因高表達,其效應蛋白-細胞因子、炎癥介質(zhì)等大量產(chǎn)生,從而引發(fā)一系列的生物學反應,造成不同程度的生物學損傷。穿透素-3(PTX3)是一種急性期反應蛋白,也是一種炎癥標志物,在炎癥級聯(lián)反應中均起著重要作用,并參與了機械牽張刺激引起的炎癥反應過程,且它們基因啟動子序列中均含有牽張反應元件,因而我們推測PTX3可能屬于牽張敏感基因。本研究擬選擇人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549為研究對象,從細胞力學的角度,研究A549在體外周期性機械牽張作用下細胞凋亡和細胞因子分泌的情況,以期為VILI發(fā)生機制提供新的理論依據(jù),并為從細胞水平研究VILI提供一個合適模型。同時以該細胞模型為基礎在細胞水平觀察體外機械牽張對A549細胞PTX3表達的影響。 方法本研究采用美國Flexercell公司生產(chǎn)的細胞柔性基底加載裝置FX4000T,該系統(tǒng)是通過一個真空泵抽吸特制的柔性細胞培養(yǎng)膜,形成負壓而使培養(yǎng)膜拉伸應變,從而使黏附生長在膜上的細胞受到張力的作用,模擬機械通氣對肺泡Ⅱ型上皮細胞的力學刺激,細胞所受力的大小正比于培養(yǎng)膜的牽拉幅度即應變率(%),加載程序由FX 4000計算機軟件自動控制。對體外培養(yǎng)的A549細胞進行周期性牽張,觀察不同機械力和不同牽張時間對細胞的影響。根據(jù)不同的處理方式分為靜止對照組(C組)和機械牽張組(A組:6%應變率;B組:20%應變率),A組和B組其他加載方案均為:頻率0.3Hz,周期性波形為方波,加載時間為1h、2h、4h和6h)。靜止對照組:應用“Flexstop”,即一個橡膠塞塞在BioFlex培養(yǎng)板的下面,阻止真空抽吸柔性細胞培養(yǎng)膜。采用Annexin V/PI檢測細胞凋亡活性,應用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡進行檢測,透射電子顯微鏡檢測和Hoechst33258單染法熒光顯微鏡觀察凋亡細胞核的形態(tài)變化。同時應用ELISA法檢測A549細胞細胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR檢測肺泡上皮細胞PTX3 mRNA表達,Western blot檢測PTX3蛋白水平。 結果與C組相比,牽張1h以上B組A549凋亡和死亡細胞百分比顯著增加(p0.01),而A組無顯著差異(p0.05),其差異主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡細胞百分比沒有顯著差異(p0.05)。B組呈時間依賴性地引起A549細胞凋亡,同時也促進細胞因子TNF-α分泌。與C組相比,B組細胞PTX3 mRNA表達和蛋白產(chǎn)生呈時間依賴性增加,B組被牽張2h引起PTX3 mRNA和蛋白表達顯著增加,分別增加6.25倍和2.58倍(p0.01),而A組細胞PTX3基因的表達沒有影響。 結論體外過度機械牽張肺泡Ⅱ型上皮細胞A549引起細胞凋亡和細胞因子TNF-α的分泌,并促進了PTX3表達,這可能在細胞力學水平為VILI提供了實驗依據(jù),同時也為后面從細胞水平研究VILI的發(fā)病機制提供了一個可行的模型。 第二部分有效干擾A549細胞穿透素3表達的siRNA的篩選 研究背景與目的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術作為特異抑制基因表達的重要手段,已被廣泛用于基因表達調(diào)控和基因功能的研究及基因治療。其基本原理是通過是21-23個核苷酸的小片段,即siRNA特異性識別其互補mRNA,促使其降解,使相關基因處于轉(zhuǎn)錄后基因沉默,從而使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。目前制備siRNA的方法有體外化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、體內(nèi)表達載體合成等,其中體外化學合成具有方便簡單的特點�；谏鲜隹紤],本研究旨在篩選有效抑制PTX3表達的體外化學合成的siRNA,從而為進一步探索其功能,并作為某些疾病的治療手段提供理論依據(jù)。 方法采用體外化學合成的方法,合成針對PTX3的siRNA各3對、陽性對照、陰性對照和熒光對照FAM-siRNA各1對,用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染A549細胞,用real-time PCR及Western-blot檢測PTX3 mRNA和蛋白表達的水平。并轉(zhuǎn)染熒光標記對照FAM-siRNA后,應用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。 結果脂質(zhì)體2000將siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞的效率為89.18%±3.26%。與空白對照組相比,3對PTX3 siRNA均有效序列顯著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表達(P0.01),其中針對PTX3最有效siRNA能將PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而陰性對照組PTX3 mRNA和蛋白的表達均無顯著差別(P0.05)。 結論化學合成的siRNA體外應用脂質(zhì)體2000能高效轉(zhuǎn)染A549,并篩選最有效干擾目的PTX3基因的siRNA,為進一步探索目的基因的功能提供理論依據(jù)。 第三部分干擾穿透素3表達對機械牽張引起A549細胞活性改變的影響 目的研究有效干擾PTX3基因表達對機械牽張引起A549細胞活性改變以及細胞因子釋放的影響,探討其在VILI中的可能作用。 方法體外培養(yǎng)于包被膠原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培養(yǎng)板的人肺泡上皮細胞A549,隨機分為空白對照組、靜止對照組、牽張組、RNAi組、RNAi+牽張組�？瞻讓φ諡槲唇o任何干預正常培養(yǎng)細胞;靜止對照組應用“Flexstop”阻止牽張;牽張組采用FX4000T細胞應變加載系統(tǒng)周期性牽張細胞,其方案為:應變率為20%,頻率為0.3Hz,周期性波形為方波,加載時間為4h; RNAi組應用lipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染特異靶向PTX3的siRNA;RNAi+牽張組于牽張前12h轉(zhuǎn)染特異靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法檢測A549細胞PTX3 mRNA表達的變化;Western blot檢測分泌PTX3蛋白;Annexin V流式細胞術檢測A549細胞凋亡;ELISA法檢測培養(yǎng)基上清中細胞因子TNF-α水平。 結果與靜止對照組相比,牽張組A549細胞PTX3基因和蛋白的表達顯著上調(diào),牽張組PTX3mRNA增加7.397±0.276倍(P0.01),牽張組和靜止對照組PTX3蛋白分別為0.647±0.019和1.590±0.060(P0.01)。而與牽張組相比, RNAi+牽張組細胞PTX3 mRNA和蛋白表達顯著抑制。與靜止對照組相比,牽張組早期凋亡和晚期凋亡細胞百分比顯著增加;而與牽張組相比,RNAi+牽張組成活細胞百分比明顯增加(85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P0.01),凋亡細胞百分比明顯降低。 結論周期性機械牽張可通過上調(diào)人肺泡上皮細胞PTX3基因和蛋白表達,導致肺泡上皮細胞凋亡增加和過度炎癥反應,這一現(xiàn)象可能與VILI的發(fā)病機制有關。PTX3作為肺泡上皮細胞上表達的機械牽張敏感基因,從而積極參與了VILI的發(fā)病機制。 第四部大潮氣量機械通氣大鼠肺部穿透素3的表達變化 研究背景與目的呼吸機所致肺損傷(VILI)是機械通氣的嚴重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計,有22%～39%進行機械通氣病人會發(fā)生VILI,死亡率高達15%～30%,嚴重影響患者預后。大潮氣量機械通氣時機械牽張應力作為一種炎癥前期刺激,能通過特定的信號通路激起炎癥級聯(lián)反應,引起VILI。PTX3是新型的促炎癥因子,在炎癥級聯(lián)反應中均起著重要作用,細胞水平研究結果顯示,過度機械牽張能顯著上調(diào)其表達,且基因啟動子序列中均含有牽張反應元件,因而我們推測PTX3作為牽張敏感基因,可能在VILI的發(fā)病機制中起著重要作用。本實驗擬研究大潮氣量機械通氣對大鼠肺部PTX3表達的影響。 方法48只健康成年雄性SD大鼠隨機分成正常對照組(C組,n=16,保持正常自主呼吸)、保護性機械通氣組(PV組,n=16,潮氣量Vt:6ml/kg,PEEP=3～5cm H2O,呼吸頻率為70次/分)、大潮氣量機械通氣組(HV組,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0),呼吸頻率為20次/分。其余通氣參數(shù)均一致,即吸呼之比為1∶2 ,吸氧濃度FiO2為35%。頸動脈和頸內(nèi)靜脈切開置管,行監(jiān)測、標本采集和液體及麻醉藥的輸注。持續(xù)檢測HR、ECG、有創(chuàng)動脈血壓(ABP)、直腸溫度量監(jiān)測。間斷進行血氣分析,計算氧合指數(shù)。機械通氣4h后處死大鼠。(1)HE染色光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理學變化;(2)檢測肺組織濕/干重比值(W/D);(3)檢測肺泡灌洗液和血清中蛋白計算肺通透指數(shù)(LPI),ELISA法檢測肺組織勻漿和肺泡灌洗液中TNF-α;(4)測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性;(5)TUNEL法檢測肺細胞的凋亡;(6)real-time PCR檢測大鼠的肺組織中PTX3基因mRNA的表達水平;(7)免疫組化法檢測肺組織PTX3蛋白的表達;(8)Western Blot檢測肺組織PTX3蛋白的含量。 結果(一)PV組與C組相比,肺損傷各項指標無顯著改變。HV組通氣4h PaO2顯著降低(P 0.05),肺組織LPI、W/D和MPO活性均顯著增加(P 0.05),組織病理學檢測表現(xiàn)急性炎性損傷性改變。HV組大鼠肺組織勻漿和肺泡灌洗液中TNF-α含量顯著大于C組和PV組(P 0.01),而C組與PV組無顯著差異(P 0.05)。TUNEL法檢測可見肺細胞凋亡改變。(二)與C組相比,HV組通氣4h后PTX3基因mRNA和蛋白表達均顯著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分別增加3.493倍和3.799倍;而PV組PTX3基因mRNA和蛋白表達均無顯著改變(P0.05)。 結論大潮氣量機械通氣能導致肺損傷,而且顯著上調(diào)了PTX3基因mRNA和蛋白表達水平,這可能與VILI的發(fā)生密切相關。
【圖文】：

圖1. VILI 的可能機制機械性損傷和生物學損傷是相互聯(lián)系的，機械性損傷可以造成生物學損傷，生物學損傷也可以加重機械性損傷。生物體內(nèi)眾多細胞長期經(jīng)受著機械力的刺激，比如肺細胞、血管內(nèi)皮細胞、膀胱平滑肌細胞等等。正常的機械刺激對于細胞的功能維持以及器官的發(fā)育是必不可少的，比如正常呼吸時肺細胞受到的伸縮刺激對于胎兒肺細胞的正常分化成熟是必需的，然而過度或不恰當?shù)臋C械力刺激導致生物學損傷。而機械力究竟是如何轉(zhuǎn)化為細胞乃至生物體的生物學信號一直是國內(nèi)外研究的熱點。研究[5]認為機械牽張刺激可以通過細胞膜整合素受體與胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導、胞膜陽離子通道改變以及較為經(jīng)典的 MAPK 通路(P38、ERK1/2、JNK、ERK5)等信號通路介導肺損傷的發(fā)生。Waters[13]報道牽張刺激可以激活陽離子通道并調(diào)節(jié) Na+-K+-ATPase活性,后者在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)水平衡起重要作用。另有研究證實細胞骨架的連接和構成為機械信號轉(zhuǎn)化為生物學反應提供生理學基礎。細胞表面粘合蛋白、整合素、細胞骨架、

圖 3 VILI 時機械力轉(zhuǎn)化為生物學信號的可能機制PTX3 是一種急性期反應蛋白，與急性期反應蛋白（CRP）和血清淀粉樣蛋白（SAP）同屬 PTX 家族，，其基因近端啟動子區(qū)含有 Pu1, AP-1, NF-κB, Sp1 和 NFIL-6 結合位點。PTX3 基因序列分析提示，其啟動子中含有牽張反應元件，并有研究已經(jīng)證實它們參與了機械牽張刺激引起的炎癥反應過程，我們推測它們可能屬于牽張敏感基因，于上游啟動水平參與了 VILI 的發(fā)病。PTX3 是一種新發(fā)現(xiàn)的由感染和炎癥部位組織細胞分泌的炎癥標志物，多種組織細胞在炎性刺激下能表達 PTX3 ，包括骨髓源性樹突細胞（DC）、內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、單核巨噬細胞、樹突細胞、滑膜細胞和軟骨細胞，還包括上皮細胞，比如腎上皮細胞和肺泡上皮細胞[17]。這暗示著 PTX3 在感染和炎癥部位具有放大先天性防御功能[18]。正常人血中 PTX3 水平較低，在炎癥和感染情況下迅速
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8

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8 胡s鉉

本文編號：2655004