發(fā)布時間：2020-05-07 20:56

【摘要】：目的： 免疫異常激活和免疫失衡是哮喘等氣道高反應(yīng)性疾病發(fā)生和持續(xù)存在的主要免疫學(xué)基礎(chǔ)。外源性抗原通過抗原提呈細(xì)胞激活淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化,激活免疫反應(yīng)。由于輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)亞群異常漂移使免疫細(xì)胞因子過高表達(dá),導(dǎo)致哮喘發(fā)病。近年來認(rèn)為氣道上皮在氣道高反應(yīng)的免疫失衡機制中可能發(fā)生作用。氣道上皮不再被僅僅看作為單純的機械屏障,而是機體內(nèi)環(huán)境與外部環(huán)境相互作用的界面,參與氣道局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)節(jié)。已知氣道上皮具有分泌炎性因子、趨化免疫細(xì)胞以及抗原提呈等功能,其結(jié)構(gòu)和功能的異常將導(dǎo)致哮喘易感性增加,有可能成為哮喘發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)。 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses, RSV)是引起嬰幼兒和成人毛細(xì)支氣管炎和肺炎的主要病原體。臨床流行病學(xué)證據(jù)顯示,RSV感染可使哮喘發(fā)生的危險性顯著增加,但其具體機制尚不清楚。本研究假設(shè),由于RSV的嗜上皮特性,其進入機體后首先感染氣道上皮組織,改變了氣道上皮細(xì)胞的免疫調(diào)控方式,誘導(dǎo)機體免疫異常激活和免疫失衡,包括氣道上皮細(xì)胞的分泌模式轉(zhuǎn)變、過度釋放炎性介質(zhì),從而導(dǎo)致Th細(xì)胞亞群異常漂移,形成哮喘的免疫易感體質(zhì)。為求證這一學(xué)術(shù)思想,本研究擬建立人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)持續(xù)感染RSV模型,觀察外周血淋巴細(xì)胞被該模型激活后Th亞群的漂移及淋巴細(xì)胞因子的釋放情況,以證實HBECs持續(xù)感染RSV后改變免疫平衡狀態(tài),進而探討其分子機制,篩選并證實分子靶點。研究內(nèi)容展開如下： (1)建立人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)持續(xù)感染RSV模型,觀察該模型對淋巴細(xì)胞的活化作用以及Th細(xì)胞亞群分布的影響； (2)分別制備正常HBECs和持續(xù)感染RSV的HBECs的基因芯片,觀察其mRNA的差異表達(dá),并篩選出編碼分泌蛋白的差異基因； (3)驗證明顯上調(diào)的編碼分泌蛋白的差異基因,觀察該基因編碼的分泌蛋白對Th亞群分化的調(diào)控功能并初步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法與結(jié)果 1.RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)對淋巴細(xì)胞的活化作用 1)構(gòu)建RSV持續(xù)感染HBECs模型 用TCID50法測定RSV毒株的毒力為1.4×106 pfu/mL,設(shè)定感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.0001,構(gòu)建RSV持續(xù)感染HBECs模型。該模型具有以下典型特征：①感染細(xì)胞仍能夠繼續(xù)分裂傳代；②傳代后的感染細(xì)胞內(nèi)可檢測到RSV持續(xù)存在的證據(jù)。光鏡下可見部分感染細(xì)胞晚期出現(xiàn)融合病變；免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)有RSV致病蛋白的熒光表達(dá)；電鏡下感染細(xì)胞的線粒體水腫,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,出現(xiàn)核周裂隙,胞漿內(nèi)有大量的溶酶體,胞核、胞漿內(nèi)均有病毒顆粒分布。2) HBECs持續(xù)感染RSV后對淋巴細(xì)胞的活化作用 體外分離外周血淋巴細(xì)胞,將其分為淋巴細(xì)胞組(L組)、RSV作用于淋巴細(xì)胞組(RL組)、正常HBECs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組(HL組)、RSV持續(xù)感染HBECs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組(HRL組),24小時后分別收獲各組淋巴細(xì)胞和上清液。PI染色、流式細(xì)胞技術(shù)測定淋巴細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期,結(jié)果顯示HRL組的S期(有絲分裂期)的細(xì)胞比例和凋亡率在四組中均最高,其次是HL組的S期細(xì)胞比例也高于L組和RL組。此項數(shù)據(jù)說明感染RSV后的HBECs可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞顯著增殖,同時又加速淋巴細(xì)胞的凋亡。正常HBECs也可刺激淋巴細(xì)胞在一定程度上增殖。單獨RSV對淋巴細(xì)胞的增殖和凋亡無明顯作用。ELISA法檢測上清液中淋巴細(xì)胞因子IL-4, IFN-γ和IL-17的水平,發(fā)現(xiàn)RSV持續(xù)感染HBECs可促使淋巴細(xì)胞大量分泌IL-4. IFN-γ和IL-17等細(xì)胞因子,正常HBECs可刺激淋巴細(xì)胞分泌一定量的IFN-γ，單獨RSV對淋巴細(xì)胞無明顯激活作用。 3)RSV感染HBECs的上清液調(diào)控Th亞群的分化 我們將細(xì)胞培養(yǎng)液、正常HBECs的上清液以及RSV持續(xù)感染HBECs的上清液分別作用于淋巴細(xì)胞24小時,免疫熒光染色后流式細(xì)胞儀測定淋巴細(xì)胞中Th2、Th17以及Treg亞群的分布。結(jié)果顯示感染RSV的HBECs上清液可促進Th2和Th17的分化并且抑制Treg的分化,正常HBECs也可一定程度上促進Th2和Th17亞群的分化。 第一部分結(jié)果說明RSV感染HBECs可促進淋巴細(xì)胞增殖、凋亡,淋巴細(xì)胞因子的釋放和Th亞群異常漂移,對淋巴細(xì)胞具有活化作用。 2.人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)感染RSV后的差異基因表達(dá) 制備正常HBECs和持續(xù)感染RSV的HBECs的mRNA基因芯片,進行基因表達(dá)譜差異分析,篩選出HBECs持續(xù)感染RSV后的差異表達(dá)基因。基因芯片結(jié)果顯示,相對于正常HBECs,感染RSV的HBECs內(nèi)有349個基因表達(dá)上調(diào),154個基因表達(dá)下調(diào)。差異基因中,有12個基因編碼分泌蛋白,其中3個基因表達(dá)下調(diào),9個基因表達(dá)上調(diào)。分泌譜中,CYR61基因是顯著下調(diào)表達(dá)(ratio0.2), GVIN1、LEP和IL8基因是顯著上調(diào)表達(dá)(ratio5)。 第二部分結(jié)果提示RSV持續(xù)感染HBECs后其mRNA表達(dá)明顯改變,從而引起支氣管上皮細(xì)胞的局部微環(huán)境發(fā)生變化。3.白介素8(IL-8)和瘦素(leptin)介導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs) 感染RSV后致Th亞群漂移作用 根據(jù)之前基因芯片的結(jié)果測得感染RSV后的HBECs中有12個編碼分泌蛋白的基因呈現(xiàn)差異表達(dá),其中上調(diào)水平最高的兩個基因分別是IL8和LEP,它們編碼的蛋白分別是白介素8(IL-8)和瘦素(leptin)。熒光定量PCR檢測IL-8和瘦素mRNA的表達(dá),結(jié)果與基因芯片一致,即HBECs在持續(xù)感染RSV后,其細(xì)胞內(nèi)IL-8和瘦素mRNA的表達(dá)相對于正常HBECs顯著上調(diào)。ELISA檢測正常HBECs和RSV持續(xù)感染HBECs的細(xì)胞上清液中IL-8和瘦素的水平。結(jié)果顯示RSV感染組的IL-8和瘦素的水平明顯高于對照組,說明HBECs持續(xù)感染RSV后過度分泌IL-8和瘦素等細(xì)胞因子。 參照ELISA檢測所得的感染RSV的HBECs的細(xì)胞上清液中IL-8和瘦素的平均濃度,我們將重組人IL-8和瘦素作用于外周血淋巴細(xì)胞,24小時后流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞中Th2、Th17和Treg亞群的分布情況。結(jié)果顯示IL-8和瘦素都可促進Th2和Th17亞群的分化,尤其是瘦素。不僅如此,IL-8與瘦素具有協(xié)同作用,共同使Th2的分化愈加增強。而IL-8和瘦素對Treg的分化均無影響。Western blotting和免疫熒光檢測淋巴細(xì)胞中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)的表達(dá)及其磷酸化水平。結(jié)果顯示,IL-8和瘦素都可以促進ERK1/2的磷酸化。 第三部分結(jié)果說明HBECs感染RSV后能夠過度分泌IL-8和瘦素,而IL-8和瘦素可能是通過活化ERK1/2信號分子來促進Th2和Th17細(xì)胞亞群的分化。結(jié)論 人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)持續(xù)感染RSV后活化外周血淋巴細(xì)胞,引起Th亞群異常漂移。同時,HBECs感染RSV后過度分泌的IL-8和瘦素可能通過活化ERK1/2信號分子在引起Th亞群漂移中發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

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本文編號：2653535