【摘要】： 前言: 急性肺損傷(acute lung injury,ALI),是呼吸系統(tǒng)疾病中的危重癥,其定義是:心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素引起的急性,進行性缺氧性呼吸衰竭,是肺部炎癥和通透性增加的綜合征。目前認為,肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應是導致各種病因所致ALl的根本原因。而目前對ALI仍沒有確切有效又安全低副作用的藥物。 隨著糖生物學的發(fā)展,某些糖類的抗炎生物學功能逐漸被認識。甘露糖這一簡單的己糖已被發(fā)現(xiàn)具有抗炎作用。甘露糖能抑制傷口愈合時的炎癥反應,抑制中性粒細胞的氧化爆發(fā),甘露糖的衍生物對腹膜炎,佐劑性關(guān)節(jié)炎有抗炎作用。那么甘露糖對炎癥過度反應的ALl有無作用?目前國內(nèi)外未見報道。 目的: 研究甘露糖對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的大鼠急性肺損傷的保護作用;并比較它與另外三種具有相同分子量的己糖(葡萄糖,半乳糖,果糖)對ALI的抗炎效應。 方法: 雄性SD大鼠,隨機分為10組:1.對照組;2.LPS組;3-6.甘露糖不同劑量組(15,45,135,405 mg/kg);7-9.葡萄糖,半乳糖,果糖(135 mg/kg)組;10.地塞米松(dexameathone,DXM)(2 mg/kg)組。通過氣管內(nèi)滴注LPS(3mg/kg)建立ALI模型,在滴注前5分和滴注后3小時,尾靜脈注射各組用藥。滴注LPS 6小時后處死動物,行肺濕/干重比,肺滲透指數(shù)(pulmonarypermeability index,PPI),支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細胞和中性粒細胞計數(shù),肺和BALF中髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α,白介素(interleukin,IL)-10檢測,并觀察光學顯微鏡下肺損傷的程度。 結(jié)果: 1.甘露糖減輕LPS誘導的肺水腫和蛋白滲出 LPS組的肺濕/干重比(4.56±0.16)與正常組(4.30±0.18)比較明顯升高(P＜0.01),DXM(陽性對照藥)(2 mg/kg)靜脈注射明顯抑制LPS誘導的肺部水腫(P＜0.05),靜脈注射甘露糖(135,405 mg/kg)減少肺濕/干重比(P＜0.05):甘露糖405 mg/kg的作用強度相當于DXM 2 mg/kg。半乳糖,葡萄糖和果糖135mg/kg靜脈注射不能減輕肺水腫。同時,甘露糖能明顯抑制PPI的上升,甘露糖135 mg/kg(4.32±0.45)和405 mg/kg(4.04±0.86)的抑制效應均強于DXM 2 mg/kg(4.37±0.88),相反,葡萄糖,半乳糖,果糖并無明顯的抑制作用。 2.甘露糖抑制LPS誘導的肺部炎癥細胞侵潤 氣道內(nèi)滴入LPS引起肺部急性的炎癥反應,使BALF中的白細胞數(shù)急劇上升。DXM(2 mg/kg)能明顯減少LPS誘導的BALF中的白細胞數(shù)(P＜0.01)。甘露糖15、45、135和405 mg/kg靜脈注射呈劑量依賴性地減少肺部炎癥細胞的聚集,使BALF中白細胞數(shù)以及中性粒細胞數(shù)明顯下降。而葡萄糖,半乳糖,果糖135 mg/kg并無明顯的抑制作用。甘露糖135 mg/kg與其它三種己糖135mg/kg的效應具有顯著性差別(p＜0.05)。 3.甘露糖對MPO和SOD活力的影響 LPS組肺勻漿中和BALF中MPO水平升高,與對照組比較分別上升了26.3%和9.5%(P＜0.05)。甘露糖劑量依賴性地減少LPS誘導的肺勻漿中和BALF中MPO活性的上升,甘露糖405 mg/kg的抑制強度相當于DXM 2 mg/kg。相反,葡萄糖,半乳糖,果糖組的肺勻漿中和BALF中的MPO均未見降低。同時,LPS組SOD活力下降,而靜脈注射甘露糖劑量依賴性地減少LPS誘導的SOD活力下降。靜脈給予DXM或其它三種己糖對SOD活力升高均無明顯作用。甘露糖135 mg/kg與其它三種同樣劑量的己糖的作用具有顯著性差異(P＜0.05)。 4.甘露糖抑制TNF-α和IL-10的產(chǎn)生 LPS組的肺勻漿和BALF中的TNF-α水平顯著上升,分別達到對照組的6倍和40倍(P＜0.01)。甘露糖劑量依賴性地減輕LPS誘導的TNF-α的上升,DXM 2mg/kg靜脈注射也有明顯的抑制作用(p＜0.05),而葡萄糖,半乳糖,果糖沒有明顯作用�？寡滓蜃�--IL-10在肺勻漿中的水平于各組中均無顯著性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。在BALF中,LPS組的IL-10水平升高,甘露糖135 mg/kg組,405 mg/kg組及DXM組的IL-10水平均有明顯下降(P＜0.05)。 5.甘露糖改善LPS誘導的肺部病理損傷 對照組大鼠肺組織HE染色可見肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁無水腫,肺實質(zhì)無明顯炎癥細胞浸潤,LPS組大鼠肺泡壁明顯水腫增厚,肺間質(zhì)中性粒細胞明顯浸潤,有出血、水腫及中性粒細胞移行至肺泡腔,肺泡腔內(nèi)透明膜形成。甘露糖45,135,405 mg/kg和DXM 2 mg/kg減輕了LPS誘導的肺部炎癥。低劑量甘露糖(15mg/kg),以及其它三種己糖并無明顯的作用。同時,LPS組肺損傷病理評分(4.8±0.4)比對照組(0.2±0.1)明顯增高(P＜0.01)。甘露糖15、45、135和405mg/kg靜脈注射呈劑量依賴性降低肺損傷病理評分,其分值分別是:4.6±0.3,3.8±0.4,2.5±0.4,及1.9±0.3。葡萄糖,半乳糖,果糖組與LPS組比較,肺損傷病理評分無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論: 靜脈注射甘露糖能降低LPS誘導大鼠急性肺損傷時的肺部毛細血管通透性的增加,減少蛋白滲出及肺水含量,減輕肺組織中PMN浸潤程度,抑制肺組織和BALF中TNF-α水平升高,降低肺組織和BALF的MPO水平,提升肺組織SOD活力,并改善肺組織炎癥病理變化。而另外三種單糖—葡萄糖,半乳糖和果糖,對LPS誘導的大鼠ALI無明顯作用。 前言: 甘露糖是一個分子量為180.2的簡單單糖,我們前一部分的實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對LPS誘導的大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷具有保護作用,它能降低LPS誘導的大鼠急性肺損傷時毛細血管通透性的增加,減少蛋白滲出及肺水含量,減輕肺組織中中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)浸潤程度,抑制肺組織和BALF中TNF-α水平升高,降低肺組織和BALF的MPO水平,提升肺組織SOD活力,并改善肺組織炎癥病理變化。國外學者也發(fā)現(xiàn)甘露糖能抑制傷口愈合時的炎癥反應,減少滲出液中中性粒細胞的數(shù)量,抑制中性粒細胞的氧化爆發(fā);甘露糖的衍生物,6—磷酸—甘露糖,對腹膜炎,佐劑性關(guān)節(jié)炎,傷口愈合時的炎癥具有抗炎作用。 雖然中性粒細胞是炎癥中重要的效應細胞,但是巨噬細胞是更為關(guān)鍵的炎癥早期時的激動細胞,巨噬細胞釋放的炎癥因子及其它介質(zhì)對中性粒細胞的粘附,募集,遷移,活化具有重要意義。在巨噬細胞表面分布有甘露糖受體(mannosereceptor,MR),其C型凝集素樣糖類識別域(C-type lectin-like domain,CTLD)能介導MR與以甘露糖、巖藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖為末端的糖類結(jié)合。MR對保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,免疫監(jiān)督(包括識別病原體,激活細胞,遞呈抗原)均有作用。是否甘露糖能通過與MR的相互作用影響炎癥狀態(tài)下巨噬細胞的的功能,從而抑制PMN募集與＼活化,減輕炎癥反應,目前國際上未見報道。 目的: 本實驗的研究的目的就在于探討甘露糖對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的離體小鼠腹腔和肺泡巨噬細胞炎癥反應的影響,并探討甘露糖受體在其中的作用。 方法: 采用腹腔灌洗和支氣管肺泡灌洗,分別提取小鼠腹腔巨噬細胞及肺泡巨噬細胞。實驗使用了兩種不同的MR阻斷方法:使用甘露聚糖競爭性抑制以及以質(zhì)粒載體干擾RNA的方法干擾甘露糖受體合成。巨噬細胞均分為:1.對照組:加入等體積培養(yǎng)液;2.LPS組,加入終濃度為1 ug/ml的LPS;3.甘露糖不同劑量組(0.01,0.1,1,10,100mM):提前5分鐘先加入不同劑量甘露糖,隨后加入LPS 1 ug/ml;4.甘露聚糖組:在加入LPS前30分鐘先加入甘露聚糖2 mg/ml,在加入LPS 1ug/ml前5分鐘加入甘露糖1mM;5.SiRNA組:于轉(zhuǎn)染細胞中提前5分鐘先加入甘露糖1mM,隨后加入LPS 1 ug/ml。加LPS 1.5h后測核因子NF-κB活性,4h后以中性紅法檢測巨噬細胞吞噬功能,16h后以ELISA法測定巨噬細胞培養(yǎng)上清TNF-α和IL-1β水平,流式細胞術(shù)檢測細胞的MR表達,RT—PCR測定胞內(nèi)TNF—α,IL-1β及MR的mRNA水平,Western Blot檢測細胞的MR蛋白表達。 結(jié)果: 1.巨噬細胞的pGCsi載體轉(zhuǎn)染:pGCsi載體轉(zhuǎn)染小鼠腹腔或肺泡巨噬細胞48h后,熒光鏡下可得Mrc1-3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率分別為40.5%和43.7%;RT—PCR測定MR的mRNA表達量分別為未轉(zhuǎn)染組細胞的54.0和56.1%;Western-blot分析提示pGCsi載體轉(zhuǎn)染后的腹腔或肺泡巨噬細胞的MR的蛋白顯著減少;流式細胞術(shù)檢測提示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組MR表達陽性細胞百分率分別下降為對照組的56.1%和59.7%。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染Mrc1-3質(zhì)粒能明顯抑制腹腔或肺泡巨噬細胞的甘露糖受體的表達,證明載體質(zhì)粒干擾MR的表達成功。 2.LPS激發(fā)巨噬細胞炎癥并下調(diào)MR表達:小鼠的腹腔或肺泡巨噬細胞以1ug/ml的LPS刺激,4h后吞噬功能明顯增強,光鏡下觀察胞內(nèi)中性紅顆粒增多增濃,攝取中性紅的吸光度(OD_(540))值顯著上升;LPS 1 ug/ml共育16h后引起腹腔或肺泡巨噬細胞細胞上清液中前炎癥因子TNF-α和IL—1β的8～44倍的劇烈上升;胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平顯著增加,提示腹腔或肺泡巨噬細胞在LPS作用下引發(fā)了炎癥性的吞噬和分泌功能的變化。同時,LPS 1 ug/ml共育16h后對腹腔或肺泡巨噬細胞的MR表達有下調(diào)作用,表現(xiàn)為流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表面MR的表達分別比正常對照組下降了31.2%和17.4%;WesternBlot檢測提示巨噬細胞MR的蛋白表達水平有明顯的下調(diào);RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表達甘露糖受體mRNA的量下降,分別約為正常對照組的67.3%和66.2%。 3.甘露糖拮抗LPS誘導的巨噬細胞炎癥并上調(diào)MR:在小鼠的腹腔或肺泡巨噬細胞中,甘露糖0,0.01,0.1,1,10,100mM呈劑量依賴性減少LPS誘導的小鼠腹腔或肺泡巨噬細胞的炎癥反應,表現(xiàn)為抑制腹腔或肺泡巨噬細胞吞噬功能,甘露糖1 mM組的吸光度分別比LPS組的吸光度下降了24.2%和11.8%;抑制腹腔或肺泡巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放,甘露糖1,10,100 mM組與LPS組相比有非常顯著的差異;甘露糖(0.1,1,10 mM)劑量依賴性地抑制腹腔或肺泡巨噬細胞的TNF-α和IL-1β的mRNA表達,甘露糖10 mM使腹腔巨噬細胞的TNF-α和IL-1βmRNA降為LPS組的66.4%和58.2%,使肺泡巨噬細胞的TNF-α和IL-1βmRNA降為LPS組的61.8%和61.3%。甘露糖在抑制巨噬細胞炎癥的同時,上調(diào)了巨噬細胞表面MR的表達。我們以抗甘露糖受體抗體作流式細胞分析,以Western Blot檢測巨噬細胞MR的蛋白表達,以RT-PCR測定胞內(nèi)MR的mRNA表達水平,均發(fā)現(xiàn)預先加入不同濃度(0.1,1,10 mM)的甘露糖,與LPS組相比,能劑量依賴性地上調(diào)巨噬細胞的MR表達水平。 4.阻斷MR,能阻斷甘露糖的抗炎效應:使用甘露聚糖2 mg/ml競爭性抑制或者以質(zhì)粒載體干擾RNA的方法干擾甘露糖受體后,再給予甘露糖1mM,則明顯抑制了甘露糖1mM原有的抗炎效應,表現(xiàn)為:對LPS誘導的增強中性紅吞噬作用無明顯抑制;不能減少LPS誘導的培養(yǎng)上清中增多的炎癥因子TNF-α和IL-1β;巨噬細胞胞內(nèi)TNF-α和IL—1βmRNA表達水平仍維持在高水平。同時,流式細胞術(shù),RT-PCR,Western Blot的檢測顯示,在預先加入甘露聚糖2mg/ml或者預先以pGCsi載體轉(zhuǎn)染后的巨噬細胞中再給予甘露糖1mM,不能提升MR的mRNA的表達水平和蛋白表達水平,相反,在LPS或者LPS和RNA干擾的雙重作用下,這兩組的MR有不同程度的下調(diào),其中載體轉(zhuǎn)染組的甘露糖受體表達水平為最低。 5.甘露糖抑制LPS所誘導的巨噬細胞核內(nèi)NF-κb/p65的表達:Western Blot檢測顯示,在正常腹腔或肺泡巨噬細胞核蛋白中有低水平的NF-κb/p65表達,經(jīng)LPS 1 ug/ml刺激1.5h后核內(nèi)NF-κb/p65表達明顯增高,分別達到正常對照組的2.4和4.5倍。預先給予甘露糖(0.1,1,10 mM),能劑量依賴性地抑制LPS所誘導的核內(nèi)NF-κb/p65高水平表達。而以甘露聚糖2mg/ml預處理,或者預先以pGCsi載體轉(zhuǎn)染后的腹腔或肺泡巨噬細胞,再給予甘露糖1mM共育1.5h,則不能阻止LPS誘導的核內(nèi)NF-κb/p65表達上調(diào)。 結(jié)論: (1)甘露糖能抑制LPS誘導的小鼠腹腔和肺泡巨噬細胞炎癥反應,抑制LPS誘導的巨噬細胞吞噬功能的增強,抑制巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-1βmRNA的合成和炎癥因子蛋白在上清中的釋放: (2)LPS對小鼠腹腔和肺泡巨噬細胞的MR有下調(diào)作用,甘露糖在發(fā)揮抗炎效應的同時對MR有上調(diào)作用; (3)以特異的MR自然配體——甘露聚糖競爭性抑制MR或以轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體干擾MR的合成后,能夠阻斷甘露糖的抗炎效應,表明甘露糖的抗炎效應至少部分是通過MR實現(xiàn)的。 (4)甘露糖能抑制LPS誘導的巨噬細胞的核因子NF-κB的活性,提示甘露糖可能通過NF-κB信號通路,進而在mRNA水平上抑制LPS所致的腹腔或肺泡巨噬細胞TNF-α、IL-1β的表達。
【圖文】：

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體來識別病原體的分子模式。MR最初在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成時為無活性的前體，自高爾基體分泌后才成為具有生物學活性的分子。甘露糖受體的四位成員都具有相似的整體結(jié)構(gòu)(見圖1)。①胞外的富含半膚氨酸區(qū)域 (cysteinerichdomain，cR):為對稱的三葉草樣結(jié)構(gòu)。具有凝集素活性，能夠結(jié)合504一4一N一乙酞半乳糖胺、504一3一N一乙酞半乳糖胺和504一3一半乳糖，這種結(jié)合無需CaZ十參與。因此能識別腺垂體激素如促黃體激素，，促甲狀腺激素，硫酸軟骨素A和B，LewiS“和Lewis!型硫酸化低聚糖。MR家族成員間的CR序列的同源性是25弓0%。②n型纖連蛋白重復區(qū)(FNn):FNn區(qū)域因與11型纖維連接蛋白 (FNn)的氨基酸序列高度相似而得名。在甘露糖受體家族成員間，此區(qū)域是最保守的，44%p叼63%的氨基酸序列相同。學者們推測FNll區(qū)域的功能是結(jié)合膠原蛋白，也己證實Endo180的FNll區(qū)域可與膠原結(jié)合
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8

【參考文獻】

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本文編號：2652177