發(fā)布時間：2020-04-28 02:43

【摘要】： 嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是本世紀初爆發(fā)的由一種新的冠狀病毒引起的傳染性疾病,主要的靶器官是肺臟,病死率達10%左右。SARS已經(jīng)淡出人們的生活已有四年多了,目前的研究主要集中在SARS發(fā)病機制和抗病毒藥物、疫苗的研發(fā)上,而這些研究的基礎(chǔ)是可靠的SARS動物模型。已有文獻報道非人靈長類(恒河猴、食蟹猴、絨猴、非洲綠猴)、小鼠(BABL/c、C57/B6、基因修飾小鼠)、倉鼠、貍子貓、雪貂等均能支持SARS-CoV的復制,其中有些動物顯示了不同程度的病理變化,但在臨床疾病和病理上仍缺乏與SARS病人的相似性。 據(jù)研究,SARS-CoV是通過其表面的S蛋白和靶細胞的表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合侵入宿主細胞的,這提示人ACE2(hACE2)轉(zhuǎn)基因鼠有可能作為對SARS-CoV易感的動物模型,因此我們進行了hACE2轉(zhuǎn)基因鼠對SARS-CoV易感性的實驗研究并利用此動物模型探討了SARS的發(fā)病機制。 本研究主要包括以下三個部分的實驗內(nèi)容: 1.hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和鑒定:選擇小鼠ACE2(mACE2)啟動子驅(qū)動的hACE2全長編碼序列(Coding sequence,CDS)基因片斷,通過顯微注射的方法,制備攜帶hACE2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)PCR檢測到4個陽性首建鼠;RT-PCR及Nested RT-PCR結(jié)果顯示在其中一個Founder的子代鼠的肺、心、腎和小腸有hACE2基因表達;Realtime-PCR檢測此Founder子代鼠轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù),結(jié)果顯示為單拷貝轉(zhuǎn)基因小鼠;Western blot結(jié)果顯示hACE2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠的不同組織包括肺、心、腎和小腸均有表達;免疫組化顯示,在轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟近曲小管上皮細胞、肺臟小血管內(nèi)皮細胞可見hACE2蛋白表達:無創(chuàng)性血壓監(jiān)測觀察發(fā)現(xiàn),hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的心率、血壓與野生鼠相比未見明顯差異;病理組織學檢查未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠心、肺、腎等器官組織結(jié)構(gòu)異常。 2.hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對SARS—CoV易感性的實驗:經(jīng)鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后,野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠接種SARS—CoV后均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在接種后的第3天和第7天,RT-PCR和免疫熒光試驗(IFA)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織上清的病毒載量和病毒滴度明顯高于野生型小鼠(P＜0.05);在接種后的第7天,轉(zhuǎn)基因小鼠的感染率明顯高于野生型小鼠(P＜0.01);轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎,而且伴有腎臟、心臟、肝臟、腦組織和胃腸道等肺外組織的損傷。而部分野生型小鼠只在感染后第三天出現(xiàn)輕微的間質(zhì)性肺炎。通過免疫組化染色,在轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞及大腦神經(jīng)細胞可發(fā)現(xiàn)SARS-CoV抗原;接種病毒后在部分感染小鼠的血清中可檢測到SARS-CoV特異性的抗體IgG和IgM,但轉(zhuǎn)基因小鼠抗體陽性率低于野生型小鼠。上述資料表明,hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對SARS-CoV的易感性明顯高于野生型小鼠。 3.利用hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠探討非特異性的免疫反應在SARS發(fā)病中的作用:應用ELISA的方法,觀察到轉(zhuǎn)基因小鼠接種病毒后,肺組織上清細胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ明顯升高;Western Blot和免疫組化染色檢測到轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS-CoV后肺組織一氧化氮合酶(iNOS)表達明顯增強,陽性顆粒主要位于肺泡巨噬細胞;比色法測定到轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS-CoV后血漿中NO含量明顯增多。 綜上所述,hACE2在我們制備的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)部分組織表達,盡管接種病毒后具有缺少病死率的局限性,但hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的易感性明顯高于野生型小鼠,病理變化與SARS病人相似。這種模型的建立對于研究SARS發(fā)病機制和抗病毒藥物的評價具有重要的意義。
【圖文】：

5，6，1為空白對照，2為野生鼠陰性對照，11為陰性鼠，7，9，10，，12為陽性estedRY-PCRA提取質(zhì)量的鑒定及濃度測定、’腎、肝、脾和小腸組織提取的總RN285和一85條帶清晰，285較亮(見圖123456

RT-PCR和NestedRT-PCR分析ACEZ的表達
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R511.9

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2642967