【摘要】： 前言 肺炎克雷伯桿菌是存在于正常人腸道及呼吸道的重要的條件致病菌，它可粘附于機(jī)體腔道粘膜表面，分泌多糖基質(zhì)，形成生物被膜(biofilm，BF)。細(xì)菌形成BF后，可逃逸機(jī)體免疫功能和抗菌藥物的殺滅作用，常常使感染變得難治、易復(fù)發(fā)，使臨床治療極為棘手。肺炎克雷伯桿菌BF在慢性肺部感染性疾病中十分常見，，它引起的BF相關(guān)感染已被臨床廣泛關(guān)注。 要對(duì)細(xì)菌BF進(jìn)行研究，首先要建立一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，體內(nèi)模型與體外模型相比，更有利于綜合考慮內(nèi)環(huán)境因素對(duì)細(xì)菌生物被膜的影響。關(guān)于肺炎克雷伯桿菌BF的體內(nèi)研究國外學(xué)者對(duì)此報(bào)道不多，國內(nèi)則未見報(bào)道。本課題采用吸入法在豚鼠體內(nèi)建立肺炎克雷伯桿菌生物被膜肺感染模型，并通過活菌計(jì)數(shù)、光學(xué)及電子顯微鏡探討肺內(nèi)肺炎克雷伯桿菌BF的發(fā)生發(fā)展變化。研究頭孢噻肟單用及與羅紅霉素合用對(duì)肺內(nèi)生物被膜肺炎克雷伯桿菌的殺菌作用，為生物被膜菌相關(guān)感染的防治提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．實(shí)驗(yàn)分組：50只豚鼠隨機(jī)分為四組：A組10只，接種滅菌生理鹽水；B組30只，接種肺炎克雷伯桿菌菌懸液；C組5只，單獨(dú)應(yīng)用頭孢噻肟(赫美羅赫斯特醫(yī)藥公司，0.5g／支，批號(hào)B011004)皮下注射；D組5只，頭孢噻肟皮下注射與羅紅霉素(法國羅素公司，150mg／片，批號(hào)731)口服合用。 2．肺炎克雷伯桿菌生物被膜肺感染模型的建立：A、B兩組 動(dòng)物均事先給予地塞米松皮下注射，劑量為3m才kgi日，每日一 次，連續(xù)七天，以抑制豚鼠免疫功能。實(shí)驗(yàn)開始后第8天，每小組 5只動(dòng)物置于與噴霧器配套的塑料容器內(nèi)，A上兩組動(dòng)物分別接 種滅菌生理鹽水及6．25 X 10、FU／Inl的肺炎克雷伯桿菌菌懸液， 通過噴霧器以0．765k才cm’壓力，噴霧40min接種。A組在接種 滅菌生理鹽水后第3＊天下組在接種肺炎克雷伯桿菌菌懸液后 第3＊＊ ＊ ＊7在1天各取5只動(dòng)物手術(shù)取出肺組織。 3．抗生素的干預(yù)：C對(duì)組動(dòng)物與A在組動(dòng)物同時(shí)以上述同 樣方法應(yīng)用地塞米松及接種肺炎克雷伯桿菌菌懸液，并于接種后 第7天開始用藥，C組單獨(dú)應(yīng)用頭抱＠M皮下注射，劑量為 100mg／kg／日，每日二次，連用三天。D組應(yīng)用頭抱＠M皮下注射 （劑量同 C組）與羅紅霉素口服K 日，每日二次）聯(lián)合應(yīng) 用，連用三天。接種后第 10天，比較 B人山三組動(dòng)物肺內(nèi)活菌數(shù) 及病理變化。 4．體內(nèi)感染肺組織活菌數(shù)的測(cè)定：取一側(cè)肺葉，用滅菌生理 鹽水行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次從去除浮游菌。無菌切取小塊 肺組織，稱取組織塊的重量，置于組織搗碎器內(nèi)，加人豆d滅菌生 理鹽水制成組織懸液，然后用滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋至 1000倍，分別取各稀釋度標(biāo)本10pl接種于血瓊脂平板上，于37℃ 培養(yǎng)過夜，并以最低可數(shù)的稀釋倍數(shù)計(jì)算菌落數(shù)＊FU人然后換算 每克肺組織有多少CFU。 CFU／克肺組織一菌落數(shù) X稀釋倍數(shù) X 100／稱重肺組織重量 5．病理學(xué)檢查：取材日，手術(shù)取出肺組織標(biāo)本，分別用10％福 爾馬林溶液及 2．5％戊二醛溶液固定lE及 PAS染色，普通光學(xué) 顯微鏡及掃描電鏡（Scanning Elecbnic Micro％opy，SEM）觀察。 6．統(tǒng)計(jì)分析 在接種細(xì)菌后第 10天對(duì) B八月三組肺內(nèi)活菌數(shù)�。� 值進(jìn) 行方差分析。 ·2· 結(jié) 果 1．B組有2只動(dòng)物于接種后第1天死亡，其余動(dòng)物在取材日 之前未再死亡。 2．肺炎克雷伯桿菌生物被膜肺感染模型的建立與鑒定 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中o組動(dòng)物肺組織內(nèi)未培養(yǎng)出細(xì) 菌人組動(dòng)物在吸人肺炎克雷伯桿菌3天以后肺內(nèi)培養(yǎng)出的細(xì)菌 菌落較小、生長緩慢、革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)菌體變短，此時(shí)肺內(nèi)細(xì)菌數(shù) 量為 10’－10’CFU／g。第7、10上今天略有增力，在 10’－10’CFU／ g之間。14天以后細(xì)菌部分被清除，體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量有所下降，第 21天時(shí)基本穩(wěn)定在10‘－10”’CFU／g。 光學(xué)顯微鏡檢查：接種肺炎克雷伯桿菌后第3天，靠近胸膜邊 緣實(shí)變肺組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞多灶性聚集，以中性粒細(xì)胞及淋巴 細(xì)胞為主。第7天，中性粒細(xì)胞減少，以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞 聚集形成顆粒樣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)外周由成纖維細(xì)胞及類上皮細(xì)胞包繞， 形成肉芽腫。第10＊ 天，肉芽腫顆粒的形成明顯增大。第門。 ZI天帶有細(xì)菌集落的肉芽腫顆粒略有減小，形成穩(wěn)定的BF菌慢 性感染。 SEM觀察：在接種細(xì)菌后第7天，肺組織的顆粒樣結(jié)構(gòu)內(nèi)可 見到多糖蛋白復(fù)合物包繞的細(xì)菌，細(xì)菌菌體之間相互以粘液絲相 連，可見到淋巴細(xì)胞嵌于其中。接種后第10天，細(xì)菌聚集成團(tuán)， 多糖蛋白復(fù)合物明顯增多。 3．抗生素的治療效果：接種細(xì)菌后第 10天，乙D二組肺內(nèi)活 菌數(shù)明顯少于 B組人組與 C組人組與 D組比較 p＜0．05人組 與 D組比較 p＜0．01。C組經(jīng)抗生素治療后肺內(nèi)的顆粒樣結(jié)構(gòu)減 小JF內(nèi)的粘液樣物質(zhì)及細(xì)菌數(shù)量減少為F厚度變薄。D組較C 組更為明顯，SEM顯示BF稀疏，細(xì)菌數(shù)量及細(xì)菌分泌的粘液樣物 ·3·
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：2636190