【摘要】： 前言 銅綠假單胞菌所致的慢性呼吸道感染是目前臨床上常見且十分難治的一種感染，其難治性往往與生物被膜(biofilm，BF)的形成有關。BF是指細菌被自身分泌的多糖基質(zhì)包繞，彼此粘連并且粘附于各種表面或界面所形成的細菌群落。BF可以保護細菌逃避宿主的免疫和抗菌藥物的殺傷作用，即使應用對銅綠假單胞菌十分敏感有效的抗生素，BF菌亦很難清除，臨床治療十分棘手。 迄今為止，國內(nèi)對BF的研究多局限于體外模型的設計和應用，而體內(nèi)模型則更有利于綜合考慮內(nèi)環(huán)境的影響，并可探討宿主因素對BF形成的影響及體內(nèi)BF菌耐藥機制。本實驗用吸入法建立銅綠假單胞菌肺感染BF模型，研究體內(nèi)細菌BF的組織學及細菌學特征，并進一步應用藥物進行干預，觀察藥物對肺部BF菌感染的作用，為防治此類感染提供依據(jù)。 實驗方法 1．銅綠假單胞菌肺感染BP模型的建立及觀察 (1)吸入法建立銅綠假單胞菌BF模型。將50只豚鼠分成四個組：A組10只，為吸生理鹽水組，作為BF模型的對照；B組30只，為BF模型建立組；C組和D組為抗生素干預組，每組5只，C組單用頭孢噻肟組，D組合用頭孢噻肟與羅紅霉素。所有動物均事先應用地塞米松抑制免疫(3mg／kg／日)，日一次，連用7天。將事先配好的濃度為6.25×10~8CFU／ml的銅綠假單胞菌菌懸液通過噴霧器以氣霧劑的形式，接種至豚鼠肺內(nèi)，A組接種生理鹽水。 每組均噴霧接種40分鐘。A組于接種后第3天和第7天取材F 組于接種后第3、7、10＼14、17及21天分別取材，C組和D組于接 種后第10天取材，每組每日各取5只動物。 p）感染肺組織（標本）取出后活菌計數(shù)。無菌取出一側(cè)肺組 織，用滅菌生理鹽水經(jīng)支氣管灌注沖洗，去除浮游菌。稱重后，置 于組織勻漿器內(nèi)勻漿，加人lml滅菌生理鹽水制成組織懸液，再做 IO倍系列稀釋，分別取各稀釋度標本IO山接種于血瓊脂平板上， 37℃過夜培養(yǎng)后計數(shù)菌落數(shù)。 櫥）普通光學顯微鏡及掃描電鏡觀察。另一側(cè)肺組織取出 后，一部分用10％福爾馬林溶液固定對E染色，用普通光學顯微 鏡觀察。另一部分標本則以2．5％戊二醛溶液固定，液氮冷凍斷 裂并經(jīng)系列處理后，用掃描電鏡觀察。 2．抗生素干預 實驗分三組，包括接種銅綠假單胞菌后不用抗生素組（B 組人單用頭飽暖股組＊組）以及合用頭抱噬股與羅紅霉素組① 組人C組及D組動物于接種后第7天開始分別應用抗生素治 療，連用3天。其中頭抱喀能每日兩次次下注射給藥問 昨g／ 日入羅紅霉素則每日兩次口服給藥矚 日八三組動物均于 接種后第10天取材。標本取出后作上述同樣處理。 3．統(tǒng)計方法：資料的性質(zhì)為計量資料，且需進行組間兩兩比 較，故采用方差分析SNK檢驗，用SPSS軟件分析處理。 實 驗 結(jié) 果 互．B組有三只動物于接種后第1天死亡，其它各組動物無死 亡。 2．銅綠假單胞菌肺感染BF模型的觀察 門則組動物于取材日肺組織培養(yǎng)均見銅綠假單胞菌生長， ·2· 第 10天時菌落數(shù)最多，為 5．25 X 10丫FU／l，第 ZI天時有所減 少，為 4．07 X 10’CFU／Inl。A組無細菌生長。 p）普通光學顯微鏡觀察／組動物肺組織除早期局部有少 許炎性細胞浸潤外，未見明顯異常。B組動物肺組織則在接種后 第3天開始于實變區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)散在分布的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)主要由炎性 細胞組成，以淋巴細胞為主。接種后第7天及14天時，，肺內(nèi)實變 明顯減輕，結(jié)節(jié)的大小同前比較增大，數(shù)目增多，外周包繞扁平的 類上皮細胞和成纖維細胞，呈現(xiàn)慢性肉芽腫樣結(jié)構(gòu)，并且多分布在 肺邊緣近胸膜處。到第21天時，肺內(nèi)肉芽腫結(jié)節(jié)仍存在，結(jié)節(jié)的 大小較先有所減小，數(shù)目亦減少。 p）掃描電鏡下見結(jié)節(jié)內(nèi)存在大量細菌，菌體被粘液樣基質(zhì) 包繞并彼此連結(jié)，中間鑲嵌有淋巴細胞。隨著時間的延長，基質(zhì)的 厚度增加。 3．抗生素干預的結(jié)果 C組和D組動物同B組比較肺組織菌落數(shù)均減少，但C組與 B組比較，統(tǒng)計學上差異不顯著對組同B組相比則存在顯著性差 異。聯(lián)合用藥后，光鏡下結(jié)節(jié)明顯變小，數(shù)目減少，電鏡下見BF 基質(zhì)的厚度明顯變��；而單用頭抱噬防組的結(jié)節(jié)大小及數(shù)目在F 基質(zhì)厚度的變化則不明顯。 討 論 1．吸人法建立的肺感染模型同臨床慢性肺部感染性疾病相接 近，有著重要的臨床意義。免疫抑制劑的應用是本實驗模型建立 的前提，在接種細菌之前應用免疫抑制劑可以促進吸人細菌在肺 內(nèi)的定植，臨床觀察亦發(fā)現(xiàn)往往免疫功能低下的病人容易形成BF 感染。國外文獻建立銅綠假單胞菌肺感染模型時用醋酸可的松抑 制免疫，我們在預實驗中用氫化可的松替代，藥物用量大門0mg／ ·3· kg／日X給藥部位組織壞死明顯。后改用地塞米松，藥物用量較 小O mg／kgi日X局部反應輕微，免疫抑制作用亦肯定。定植在肺 內(nèi)的細菌即以BF的形式在體內(nèi)長期存在，形成一種穩(wěn)定的慢性 感染。本實驗建立的模型可用于較長期的實驗研究。 2．國外文獻
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R56

【參考文獻】

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1 谷秀,李勝岐,張智潔,劉勇,李強,潘莉莉;銅綠假單胞菌生物被膜中β-內(nèi)酰胺酶活性的檢測[J];中華內(nèi)科雜志;2001年09期

本文編號：2629685