【摘要】： 海水淹溺(Sea water drowning)不僅常發(fā)生于航海事故、海上作業(yè)、海上旅行等,而且是軍隊(duì)海上訓(xùn)練和作戰(zhàn)減員的重要原因[1]。海水淹溺可導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI),嚴(yán)重者可發(fā)展為海水型呼吸窘迫綜合征(sea water respiratory distress syndrome, SW-RDS),病情嚴(yán)重,救治極為困難[2]。因此,研究海水型ALI的早期救治,并防止其向SW- RDS轉(zhuǎn)化,具有重要的意義。有學(xué)者報(bào)道地塞米松可以減輕海水淹溺后急性肺損傷,但具體機(jī)制尚不明確[3-4]。普遍認(rèn)為TNF-α是導(dǎo)致ALI/ARDS的啟動(dòng)因子[5-7],而海水淹溺后TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)及地塞米松對(duì)海水淹溺后巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α分子表達(dá)的影響尚未報(bào)道。本研究試圖闡明TNF-α在SW-RDS發(fā)病機(jī)制中的作用,探索地塞米松對(duì)海水型ALI的治療機(jī)制。 目的:通過(guò)向兔氣管內(nèi)灌注海水,模擬海水淹溺后導(dǎo)致ALI生理過(guò)程,在灌注后不同時(shí)點(diǎn)觀察AM內(nèi)TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá),并應(yīng)用地塞米松(Dexamethasone , Dex)進(jìn)行干預(yù),探討地塞米松對(duì)海水淹溺急性肺損傷的治療作用及相應(yīng)的機(jī)制。 方法: 1.實(shí)驗(yàn)分組 健康新西蘭大耳兔40只(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重(2.50±0.36)kg。為觀察海水淹溺后肺泡巨噬細(xì)胞(AM)內(nèi)TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá),25只兔隨機(jī)分成5組:海水淹溺后0min(正常對(duì)照組)、30、60、90、120min時(shí)點(diǎn)組;為了解地塞米松對(duì)海水淹溺后AM內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)的影響,15只兔隨機(jī)分為3組(每組5只):①對(duì)照組(Control group,C組):僅作氣管插管,不作其他處理;②海水淹溺組(Model group,M組):制備動(dòng)物模型,以等量生理鹽水代替地塞米松靜脈注射。③地塞米松治療組(Treatment group,T組):模型建立后立即靜脈注射地塞米松2mg/ kg ,隨即以(1mg·kg - 1·h - 1)靜脈維持。 2.建立海水淹溺家兔急性肺損傷模型 3.動(dòng)脈血?dú)夥治龈鹘M均于手術(shù)或模型建立后0min、30min、60min、90min、120min經(jīng)左側(cè)股內(nèi)動(dòng)脈采集0.5ml動(dòng)脈血注入抗凝試管用于動(dòng)脈血?dú)夥治?采血0.6ml,血?dú)夥治鲇傻谒能娽t(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院血?dú)?肺功能室測(cè)定。 4.支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集:25只時(shí)點(diǎn)組兔于上述各時(shí)點(diǎn)放血處死,C組、M組、T組于100分鐘放血處死,隨后開胸、夾閉氣管取全肺。左側(cè)肺葉作肺泡灌洗:生理鹽水以5 ml/次,共10 ml,回收率70%左右。 5.肺組織的離體觀察 分別于致傷后0min、30min、60min、90min、120min分批處死家兔,取肺組織,觀察肺臟的肉眼變化,并使用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。肺組織含水量測(cè)定:采用干濕重稱重法測(cè)定::取得右肺上、中葉,稱取肺濕重(W) ,而后置于100℃恒溫烤箱內(nèi)48h至重量恒定后稱肺干重(D) ,肺含水量=(肺濕重-肺干重)/肺干重。取左肺下葉組織稱重標(biāo)記,冷凍保存于-70℃環(huán)境。測(cè)量腫瘤壞死因子a(TNF-a)、IL-10的含量。各組于右下葉同等部位取0.5g肺組織置于10%福爾馬林溶液中,固定組織塊,經(jīng)石蠟包埋切片,HE染色后,觀察組織病理學(xué)改變。 6.肺泡巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將支氣管肺泡灌洗液1 000 r/min離心10 min,沉淀用D-Hank液洗滌,以RPMI-1640懸浮后,置25 mL玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%二氧化碳、PH 7.2條件下培養(yǎng)4小時(shí),等AM黏附于玻璃表面,再用培養(yǎng)液沖洗掉未黏附的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等,分離純化的AM以瑞氏染色證實(shí)為巨噬細(xì)胞,純度95%,臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力90%。 7.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)兔肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-a mRNA表達(dá) 結(jié)果 (1)血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示, PE-SWD模型建立后, 60min時(shí), PaO2降低到到最低點(diǎn)(31.6±4.98mmHg, 1mmHg=0.133 kPa)后逐漸升高,到120分鐘再次降低;PCO2在30min升至最高點(diǎn),后逐漸回復(fù),可能與家兔代償性過(guò)度通氣有關(guān);PH值和D/W在模型建立后進(jìn)行性下降。 (2)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示:大體標(biāo)本可見海水淹溺后雙肺表面散在暗紅色片狀區(qū)及點(diǎn)狀出血區(qū),以雙下肺背側(cè)為主,呈“紅色肝樣變”,肺組織切面及氣管腔內(nèi)有中量血性粉紅色泡沫樣液體滲出。以地塞米松治療后的T組亦可見基本相同的肺損傷區(qū)域,但總體顏色較淡。HE染色(×100倍)下,M組可見肺泡及肺間質(zhì)水腫明顯,肺出血、肺泡隔斷裂,肺泡腔及微血管中大量炎癥細(xì)胞(主要為中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn),肺損傷程度嚴(yán)重;而T組肺泡擴(kuò)張、水腫明顯,肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕,肺損傷程度較M組減輕。 (3) RT-PCR方法檢測(cè)海水淹溺后家兔AM內(nèi)TNF-αmRNA的表達(dá)即開始上升,隨時(shí)間增加逐漸增高.90分鐘左右達(dá)到高峰,之后輕微下降,但仍明顯高于正常對(duì)照組(P0.01)。C組AM中TNF-αmRNA僅有輕微表達(dá),M組顯著升高(P0.01):T組顯著低于M組(P0.05)。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兔PO2、PH進(jìn)行性下降,提示肺換氣功能受損嚴(yán)重,符合ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn),表明海水淹溺致急性肺損傷兔模型構(gòu)建成功。 2. SW-RDS家兔肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-a mRNA的表達(dá)水平在模型建立后即開始升高(P0.01),說(shuō)明SW-RDS原因可能與肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA高表達(dá)有關(guān);對(duì)SW-RDS動(dòng)物模型AM中TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)分析,提示急性肺損傷時(shí)TNF-a mRNA主要在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá),且與急性肺損傷程度相關(guān)。 3.本實(shí)驗(yàn)以地塞米松治療患SW-RDS的家兔后,病理結(jié)果顯示T組兔肺水腫情況較M組輕微而且回復(fù)較快,同時(shí)T組AM中TNF-αmRNA顯著低于M組,說(shuō)明地塞米松可降低海水淹溺兔急性肺損傷肺泡巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA的高表達(dá),減輕PE-SWD肺損傷程度,達(dá)到對(duì)急性肺損傷的治療。
【圖文】：

模型建立后TNF-α mRNA的表達(dá)即開始上升,隨時(shí)間增加逐漸增高.90分鐘左右達(dá)到高峰,之后輕微下降,但仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),見圖1。（A）（B）0min 30min 60min 90min 120min MARK圖1：海水淹溺后家兔肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-a mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)注：（A）運(yùn)用Gel-Proanalyzer version 3.0半定量密度分析結(jié)果表明,正常對(duì)照組TNF-α mRNA的擴(kuò)增片段僅有微量表達(dá),其值為(0.142 ±0.056); 淹溺后30 、60 、90 、120min 顯著高于正常對(duì)照組( P < 0. 01) ,淹溺后90min 達(dá)到高峰(1.204 ±0.130) ,之后稍有下降,可能與體內(nèi)分泌抗炎因子有關(guān)[5,6]。（B）瓊脂糖電泳分析海水淹溺后不同時(shí)間TNF-a mRNA的表達(dá)。電泳結(jié)果顯示各組在淹溺不同時(shí)間367bp處均可見強(qiáng)弱一致的擴(kuò)增帶,此為β-actin mRNA 擴(kuò)增條帶；在267bp 處有強(qiáng)弱不同
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R649.3;R563.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2628639