【摘要】：研究背景及研究目的:肺纖維化是一種病因不明的彌漫性肺病,其預(yù)后差,發(fā)病率增長迅速。其機(jī)制尚不清楚,尋找更安全的防治靶點(diǎn)仍是難題。上皮細(xì)胞受損、持續(xù)炎癥反應(yīng)、肺成纖維細(xì)胞過度活化和遷移、膠原的病理性沉積是肺纖維化的重要進(jìn)程。其中,肺成纖維細(xì)胞功能的改變是其發(fā)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)。熱休克蛋白90(Heat Shock Protein90,Hsp90)參與組織損傷與修復(fù),Hsp90抑制劑可改善多種器官纖維化,但其嚴(yán)重的副作用影響臨床應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn),Hsp90的另一種表型,分泌型Hsp90α(eHsp90α)細(xì)胞在各種刺激下被分泌到細(xì)胞外,其與LRP-1受體結(jié)合促進(jìn)傷口愈合、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)化。但eHsp90α在肺纖維化中作用鮮有報(bào)道。本課題組具備eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7。因此,我們旨在通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索:1.eHsp90α在肺纖維化中表達(dá)、作用和機(jī)制;2.1G6-D7能否改善肺纖維化,并初步探索其作用機(jī)制。方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1 C57BL/6 小鼠分為 Control(Ctrl)組、BLM 組、1G6-D7 組、1G6-D7+BLM組。BLM組、1G6-D7+BLM組小鼠氣管內(nèi)注射BLM,Ctrl組注射等量生理鹽水;1G6-D7+BLM組、1G6-D7組滴鼻吸入1G6-D7,連續(xù)5天/周,共3周。收集血清及肺泡灌洗液,Elisa檢測(cè)血清e(cuò)Hsp90α,肺泡灌洗液eHsp90α、IL-6、IL-4、INF-γ;肺組織行HE及Masson染色,免疫組化檢測(cè)α-SMA、collagen I,Western Blot 檢測(cè) α-SMA、collagen I、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含有10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL-1進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分為 ctrl 組、1G6-D7 組、TGF-β1 組、1G6-D7+TGF-β1 組。收集 TGF-β1 刺激HFL-1后的培養(yǎng)上清,濃縮后檢測(cè)eHsp90α;Western Blot檢測(cè)α-SMA、collagen I、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。結(jié)果:1.肺纖維化小鼠及TGF-β1的HFL-1細(xì)胞eHsp90α增加:BLM肺纖維化小鼠肺泡灌洗液及血清e(cuò)Hsp90α明顯增高。TGF-β1可誘導(dǎo)HFL-1的培養(yǎng)上清中eHsp90α 增加。2.1G6-D7改善BLM所致的肺部結(jié)構(gòu)破壞及膠原沉積:病理染色顯示1G6-D7可改善BLM所致肺泡間隔增厚和結(jié)構(gòu)破壞,減輕炎癥細(xì)胞浸潤、抑制成纖維母細(xì)胞灶形成和膠原增生沉積。免疫組化顯示BLM使小鼠肺部表達(dá)α-SMA、collagenI陽性的細(xì)胞明顯增加;WesternBlot發(fā)現(xiàn)TGF-β1使HFL-1細(xì)胞表達(dá)α-SMA、collagen I 增加。而 1G6-D7 處理可抑制 α-SMA、collagen I 的表達(dá)。3.1G6-D7部分糾正BLM肺纖維化小鼠肺部炎癥因子紊亂:BLM肺纖維化小鼠的肺泡灌洗液中IL-6和IL-4增高,1G6-D7處理可抑制此反應(yīng)。然而,BLM使纖維化小鼠肺泡灌洗液中INF-γ減少,1G6-D7滴鼻治療可使INF-γ的表達(dá)部分恢復(fù)。4.1G6-D7調(diào)節(jié)肺纖維化信號(hào)分子的活性:BLM肺纖維化小鼠的肺組織及TGF-β1 誘導(dǎo)的 HFL-1 細(xì)胞中 LRP-1、p-Akt、p-ERK、p-P38 高表達(dá),能被 1G6-D7有效抑制。結(jié)論:1.eHsp90α可能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化和膠原合成分泌參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。2.1G6-D7可改善BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化,其機(jī)制可能是通過抑制eHsp90α激活LRP-1受體及下游Akt/ERK/P38等信號(hào)通路,減少肺成纖維細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)合成。
【圖文】：

ｇ邋８邐■邐0邋２００邋ｔ邋■—逡逑Ｉ邐Ｍｉｌｌ逡逑ｉ邋＾邋＾ｌｉｉ邐１邋５0邋１１１１逡逑圖１肺纖維動(dòng)物模型中ｅＨｓｐ９０ａ的表達(dá)。圖１Ａ：肺泡灌洗液ｅＨｓｐ９０ａ，ｎ＝６邋（＊尸＜０．０５，對(duì)逡逑比邋Ｃｔｒｌ邋組；＃尸＜０．０５，對(duì)比邋ＢＬＭ邋組）；圖邋１Ｂ：血清邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋Ｐ＜０．０５，對(duì)比邋Ｃｔｒｌ逡逑組；＃戶＜０．０５，對(duì)比ＢＬＭ組）逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋Ｈｓｐ９０ａ邋ｉｎ邋ＢＬＭ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｐｕｌｍｏｎａｒｙ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｍｉｃｅ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑Ｆｉｇ．邋］邋Ａ：邋Ｅｌｉｓａ邋ｏｆ邋ＢＡＬＦ邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋戶＜０．０５，邋ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃尸邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）；邋Ｆｉｇ．】Ｂ：逡逑Ｅｌｉｓａ邋ｏｆ邋ｓｅｒｕｍ邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋Ｐ＜０．０５，邋ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；ｕ邋Ｐ邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）逡逑２０逡逑

圖４邐１Ｇ６－Ｄ７對(duì)肺纖維化小鼠肺部炎癥因子的影響，ｎ＝６邋（＊尸＜０．０５，對(duì)比Ｃｔｒｌ組，Ｐ＜０．０５，逡逑對(duì)比ＢＬＭ組）逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋１Ｇ６－Ｄ７邋ｏｎ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｉｎ邋ｐｕｌｍｏｎａｒｙ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｍｉｃｅ，邋ｎ＝６邋（＊邋尸＜０．０５，逡逑ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）逡逑７．４邋１Ｇ６－Ｄ７對(duì)小鼠肺纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響逡逑肺纖維化標(biāo)志蛋白如ａ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ表達(dá)變化是肺纖維化的重要特征之逡逑一。我們同時(shí)應(yīng)用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ及免疫組化的方法檢測(cè)小鼠肺部纖維化標(biāo)志蛋白逡逑的表達(dá)，重點(diǎn)觀察１Ｇ６－Ｄ７對(duì)ｃｔ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ表達(dá)的影響。免疫組化的結(jié)果顯逡逑示，單純滴鼻給予１Ｇ６－Ｄ７并不影響ａ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎｌ的表達(dá)（棕色），而單次氣逡逑管內(nèi)給予ＢＬＭ便可明顯誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)ａ－ＳＭＡ、ｃｏｌｌａｇｅｎ逡逑Ｉ增加，細(xì)胞夕卜ｃｏｌｌａｇｅｎ他顯著增加。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ結(jié)果也同樣顯示，，單純１Ｇ６－逡逑Ｄ７組標(biāo)志蛋白的表達(dá)對(duì)比Ｃｔｒｌ組無明顯變化，而ＢＬＭ組小鼠肺部ａ－ＳＭＡ及逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：2628437