【摘要】：Dex和TP抑制活化PBMCs表達(dá)IL-4、IL-5和IL-13機(jī)制的研究 支氣管哮喘是一種嚴(yán)重危害人民身體健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。近年來(lái),其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。目前認(rèn)為,支氣管哮喘是以氣道狹窄、高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的一組綜合征,氣道的炎癥是前兩者的基礎(chǔ)。在多種遺傳和環(huán)境因素共同作用下,經(jīng)過(guò)巨噬細(xì)胞(包括樹(shù)突狀細(xì)胞)的抗原呈遞作用,相關(guān)淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞等)被活化,釋放IL-4、IL-5、IL-13等多種Th2細(xì)胞因子,促進(jìn)了支氣管哮喘的形成和發(fā)展。 既往研究表明,哮喘患者支氣管粘膜、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)組蛋白乙�；�(HAT)活性明顯高于正常對(duì)照,組蛋白去乙�；�(HDAC)活性則減弱。應(yīng)用HDAC抑制劑TSA抑制HDAC活性后,PBMCs能向Th2表型轉(zhuǎn)化,IL-4、IL-5和IL-13等Th2細(xì)胞因子表達(dá)明顯增加。上述研究表明,HDAC/HAT活性可能與T細(xì)胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控密切相關(guān),但其中的機(jī)制尚待明確。 CD3/CD28雙信號(hào)通路對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激能夠模擬其在體內(nèi)受抗原活化產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子的過(guò)程。本課題觀察PBMCs經(jīng)CD3/CD28活化后HDAC/HAT活性的變化及IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A的基因表達(dá),研究HDAC/HAT和IL-17A在哮喘和過(guò)敏性疾病中的作用,并探討糖皮質(zhì)激素地塞米松(dexamethasone,Dex)和平喘中藥雷公藤有效成分雷公藤甲素(Triptolide,TP)抑制活化PBMCs表達(dá)IL-4、IL-5和IL-13的機(jī)制。 第一部分: PBMCs活化后HDAC /HAT活性的動(dòng)態(tài)變化 目的:研究PBMCs在CD3/CD28單克隆抗體共刺激活化后,細(xì)胞核內(nèi)HDAC /HAT活性的動(dòng)態(tài)改變,以及Dex和TP對(duì)兩者活性的影響,探討HDAC /HAT在支氣管哮喘等過(guò)敏性疾病中的發(fā)病機(jī)制。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)雙信號(hào)通路對(duì)PBMCs進(jìn)行共刺激,分別在0min、1h、4h、24h時(shí)采用熒光酶聯(lián)免疫法觀察HDAC /HAT活性,并觀察不同濃度的Dex和TP對(duì)兩者活性的影響。 結(jié)果:PBMCs細(xì)胞在CD3/CD28共刺激活化后,細(xì)胞核內(nèi)的HDAC活性逐漸減弱,而HAT活性逐漸增強(qiáng),并且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。Dex(10-8M、10-10M)和TP(100nM、500nM)可抑制HAT活性和增強(qiáng)HDAC活性,其抑制效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性。 結(jié)論:PBMCs細(xì)胞經(jīng)過(guò)CD3/CD28共刺激活化后細(xì)胞核內(nèi)HDAC活性減弱,而HAT活性增強(qiáng),可能是哮喘氣道變應(yīng)性炎癥的形成和發(fā)展機(jī)制之一;Dex和TP抑制PBMCs的HAT活性和增強(qiáng)HDAC活性,可能是其減輕哮喘氣道炎癥的重要機(jī)制之一。 第二部分:Dex和TP抑制活化PBMCs表達(dá)IL-4、IL-5和IL-13的機(jī)制 目的:研究PBMCs在CD3/CD28單克隆抗體共刺激活化后,細(xì)胞內(nèi)IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá),以及Dex和TP對(duì)三者表達(dá)的影響。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)對(duì)PBMCs進(jìn)行共刺激,分別在0min、24h、48h、72h時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的蛋白濃度;并用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)PBMCs分別在0min、6h、12h、24h不同時(shí)間段,細(xì)胞內(nèi)IL-4、IL-5和IL-13mRNA的表達(dá)水平;同時(shí)觀察不同濃度的Dex和TP對(duì)上述三種細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 結(jié)果: CD3/CD28單克隆抗體刺激的PBMCs培養(yǎng)上清中的IL-4、IL-5和IL-13的蛋白濃度明顯升高,呈時(shí)間依賴性。Dex和TP可不同程度降低IL-4、IL-5和IL-13的蛋白水平,其效應(yīng)呈濃度依賴性。CD3/CD28單克隆抗體共刺激后,PBMCs內(nèi)IL-4、IL-5和IL-13 mRNA表達(dá)增加,在24h時(shí)TP(100nM、500nM)和Dex(10-8M)均能夠明顯抑制三者基因的表達(dá)。 結(jié)論:PBMCs經(jīng)CD3/CD28單克隆抗體刺激免疫活化后,其分泌的IL-4、IL-5和IL-13明顯增加,是哮喘氣道變應(yīng)性炎癥的形成和發(fā)展機(jī)制之一。Dex和TP可能是通過(guò)抑制HAT活性、增強(qiáng)HDAC活性,抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎癥基因的表達(dá)。 第三部分:TP對(duì)活化PBMCs細(xì)胞IL-17A和IFN-γ表達(dá)的影響 目的:研究PBMCs細(xì)胞在CD3/CD28單克隆抗體共刺激活化后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A和IFN-γ蛋白表達(dá)水平,以及TP對(duì)兩者蛋白表達(dá)的影響。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)對(duì)PBMCs進(jìn)行共刺激,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA方法)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A和IFN-γ蛋白濃度,同時(shí)觀察不同濃度TP(100nM、500nM)對(duì)上述兩種蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果:PBMCs經(jīng)CD3/CD28單克隆抗體刺激后,其分泌的IL-17A和IFN-γ在6h內(nèi)即明顯增加,并在24h內(nèi)呈繼續(xù)增高的趨勢(shì);100nM和500nM濃度的TP均能夠顯著抑制該細(xì)胞分泌IL-17A和IFN-γ。結(jié)論:PBMCs經(jīng)CD3/CD28刺激活化后,其分泌的IL-17A明顯增加,可能是哮喘氣道變應(yīng)性炎癥的形成和發(fā)展機(jī)制之一;TP抑制PBMCs分泌IL-17A,可能是其治療哮喘的機(jī)制之一。 綜合上面三部分結(jié)果,我們可以得出:①HDAC/HAT活性可能與T細(xì)胞IL-4、IL-5和IL-13等Th2細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控密切相關(guān);②Dex和TP可能是通過(guò)抑制HAT活性、增強(qiáng)HDAC活性,從而抑制了IL-4、IL-5、IL-13等炎癥基因的表達(dá);③TP可通過(guò)抑制PBMCs對(duì)IL-17A的分泌,從而在哮喘和過(guò)敏性疾病中發(fā)揮一定的治療作用。
【圖文】：

*同 CD3/CD28 刺激組相比，P <0.05#同 0min 相比，P <0.05圖 1：PBMCs 活化后 HDAC 活性變化，及 Dex 對(duì)其活性的影響PBMCs 在 CD3/CD28 共刺激活化后，細(xì)胞核內(nèi)的 HDAC 活性在 1h 即明顯減弱，在第 24h，仍有進(jìn)一步減弱的趨勢(shì)。Dex 在 24h 內(nèi)可明顯抑制 HDAC 的活性減弱，其抑制效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴。（圖 1）

*同 CD3/CD28 刺激組相比，P <0.05#同 0min 相比，P <0.05圖 2：PBMCs 活化后 HAT 活性變化，及 Dex 對(duì)其活性的影響PBMCs 在 CD3/CD28 共刺激活化后，細(xì)胞核內(nèi)的 HAT 活性在 1h 明顯在第 24h，，仍有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢(shì)。Dex 在 1h 起即有部分抑制 HAT 活性的這種抑制效應(yīng)抑制持續(xù)到 24h。（圖 2）2.PBMCs 活化后 HDAC/HAT 活性的動(dòng)態(tài)變化，以及 TP 對(duì)兩者活性的影###******
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜永成,蔣毅,劉立新;雷公藤防治哮喘的作用機(jī)制[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊(cè);2005年09期

2 王超霞;王守紀(jì);曲政海;;小劑量雷公藤佐治兒童糖皮質(zhì)激素依賴性哮喘的效果[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

3 黃啟輝,江山平,陳廣穗,喻永鴻;雷公藤甲素對(duì)激素抵抗型哮喘患者血清Th_2細(xì)胞因子水平和肺功能的影響[J];中國(guó)中醫(yī)藥科技;2003年02期

4 沈其昀,王利民,王健華,許以平,朱麗君;雷公藤多甙對(duì)哮喘患者T_H1/T_H2細(xì)胞因子平衡狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2002年03期

5 來(lái)茶云,楊朝喜,黃彤,洪守書(shū);雷公藤多甙治療重型、偏重型小兒支氣管哮喘的臨床療效觀察[J];實(shí)用兒科雜志;1987年01期

6 林科雄,王長(zhǎng)征,錢桂生;雷公藤多甙對(duì)哮喘患者Th_1、Th_2細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2001年01期

本文編號(hào)：2626743