發(fā)布時(shí)間：2020-04-13 11:51

【摘要】：支氣管哮喘是一種呼吸系統(tǒng)的常見病,全球發(fā)病率、死亡率逐年增高。慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)(AHR)及氣道重建是哮喘主要特征。其中,氣道重建導(dǎo)致氣流不可逆的阻塞及持續(xù)氣道高反應(yīng),是哮喘治療變得困難的因素之一。因此,深入探討氣道重建的機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)新的、有效的哮喘治療方法具有重要意義。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激、吸煙、過敏原、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等多種因素參與了氣道重建,而EGFR活化發(fā)揮中心調(diào)節(jié)作用。EGFR及其配體在氣道重建中的作用復(fù)雜,進(jìn)一步研究調(diào)節(jié)EGFR和配體活性機(jī)制,成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。本課題建立小鼠慢性哮喘模型,觀察氣道結(jié)構(gòu)改變、肺組織EGFR表達(dá)變化、BALF中EGFR配體TGF-α濃度變化及地塞米松的干預(yù);體外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步觀察EGFR活化在TGF-α、IL-13、TNF-α促氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。以期為哮喘氣道重建的防治提供新思路。本課題分為五部分。 第一部分 慢性哮喘小鼠模型的建立 目的:建立小鼠慢性哮喘模型。方法:將OVA20μg加2.6mg氫氧化鋁溶于PH為7.4的PBS0.2ml中,于第0、7、14天給BALB/c小鼠腹腔注射;于第20天至第29天、第47天、第61天、第73天至第75天鼻腔內(nèi)滴入OVA抗原液100μg。常規(guī)病理切片觀察小鼠肺內(nèi)炎癥情況、氣管壁厚度及氣道平滑肌厚度。檢測(cè)BALF中細(xì)胞數(shù)。測(cè)定氣道對(duì)腺苷、乙酰膽堿的反應(yīng)性。結(jié)果:OVA致敏、激發(fā)后小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣;氣管、支氣管及血管周圍大量炎癥細(xì)胞聚集;BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均較對(duì)照組顯著升高(P0.01);氣管壁及氣道平滑肌增厚(P0.01);氣道對(duì)腺苷、乙酰膽堿的反應(yīng)性增高(P0.01)。結(jié)論:用OVA致敏、激發(fā),可以成功建立小鼠慢性哮喘模型。 第二部分 慢性哮喘小鼠肺內(nèi)EGFR及其配體TGF-α的表達(dá) 目的:探討EGFR系統(tǒng)在慢性哮喘小鼠氣道重建中的作用。方法:建立慢性 WP=6 哮喘小鼠模型,ELISA法測(cè)定BALF中TGF-α的濃度,RT-PCR觀察小鼠肺部EGFR mRNA的表達(dá),免疫組化及Western Blot觀察EGFR蛋白的表達(dá)。結(jié)果:慢性哮喘組小鼠BALF中TGF-α濃度、肺組織EGFR mRNA及EGFR蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組均增高(P0.01)。結(jié)論:慢性哮喘小鼠BALF中TGF-α的濃度、肺組織EGFR的表達(dá)增高。 第三部分TGF-α對(duì)小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)制 目的:探討TGF-α對(duì)小鼠ASMC促增殖作用及其機(jī)制。方法:分離和培養(yǎng)正常小鼠氣道平滑肌細(xì)胞。免疫組化觀察ASMC EGFR的表達(dá)。用四唑鹽(MTT)比色法和3H-TdR摻入法測(cè)定加入TGF-α ASMC增殖情況。采用3H-TdR摻入法和MTT法觀察AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin對(duì)TGF-α促ASM增殖的影響。用Western Blot方法測(cè)定加入不同濃度TGF-α、不同時(shí)間及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表達(dá)。結(jié)果:用MTT和3H-TdR摻入法測(cè)定ASMC培養(yǎng)液中加入TGF-α后ASMC增殖比對(duì)照組明顯增加,并呈時(shí)間和濃度依賴性(P0.01)。AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin抑制TGF-α促ASMC增殖(P0.01)。免疫組化顯示EGFR表達(dá)于ASMC 細(xì)胞膜上。經(jīng)Western Blot檢測(cè),TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表達(dá)增高,并呈時(shí)間和濃度依賴性(P0.05)。AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表達(dá)的增加(P0.01)。結(jié)論:TGF-α激活EGFR為磷酸化EGFR,從而通過:1 ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑;2 PI3K-PKC-IKK途徑,促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠ASMC的增殖。 第四部分 EGFR在IL-13、TNF-α促小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用 目的:探討EGFR在IL-13、TNF-α促體外培養(yǎng)小鼠ASMC增殖中的作用。方法:分離和培養(yǎng)正常小鼠ASMC。用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)分別加入IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α后,ASMC活細(xì)胞數(shù)。采用3H-TdR摻入法和MTT法觀察AG1478、225mAb、TGF-α中和抗體, EGF中和抗體, HB-EGF中和抗體對(duì)IL-13、TNF-α促ASMC增殖的影響。用ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-α的濃度,RT-PCR檢測(cè)各組ASMC EGFR mRNA的表達(dá),Western Blot檢測(cè)ASMC EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)。結(jié)果:ASMC細(xì)胞數(shù)及3H-TdR摻入量,IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α組較對(duì)照組增多,IL-13+ TNF-α組增多最為明顯,IL-13組次之(P0.05)。IL-13、TNF-α組MTT值及3H-TdR摻入量均較對(duì)照組增高(P0.01),AG1478、 WP=7 225mAb抑制其增高(P0.01)。經(jīng)RT-PCR分析,TNF-α組EGFR mRNA的表達(dá)較對(duì)照組增加(P0.01)。經(jīng)Western Blot檢測(cè),TNF-α組ASMC EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng)(P0.01),IL-13組ASMC磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng)(P0.01),加入AG1478、225mAb后抑制ASMC 磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)的增加(P0.01)。IL-13+TGF-α中和抗體組、TNF-α+TGF-α中和抗體組MTT值及3H-TdR摻入量分別低于IL-13、TNF-α組。1h、3h IL-13組、TNF-α組細(xì)胞上清液中TGF-α量比對(duì)照組增加(P0.01)。結(jié)論:IL-13刺激ASMC分泌TGF-α,TGF-α與EGFR結(jié)合,EGFR活化,引起體外培養(yǎng)的小鼠ASMC的增殖。TNF-α刺激ASMC分泌TGF-α,及EGFR mRNA和蛋白表達(dá),TGF-α與EGFR結(jié)合,EGFR活化,引起體外培養(yǎng)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖。 第五部分 地塞米松對(duì)慢性哮喘小鼠氣道重建及EGFR表達(dá)的影響 目的:地塞米松對(duì)慢性哮喘小鼠氣道重建及EGFR系統(tǒng)的影響。方法:建立小鼠慢性
【圖文】：

0%(Per為“舒張”狀態(tài)的Pe)。）、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比用 t 檢驗(yàn)， P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果）、一般情況觀察B 組小鼠經(jīng)OVA 抗原液激發(fā)后 ,出現(xiàn)張口喘息 ,腹部翕動(dòng) ,易激惹 ,煩躁不,且出現(xiàn)噴嚏頻頻 ,飲水增多。而對(duì)照組小鼠行動(dòng)敏捷 ,未見異常。）、病理學(xué)變化及圖像分析B 組小鼠鏡下可見氣道周圍大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，上皮受損 ,氣道壁不完整。氣道腔內(nèi)粘液分泌增多 ,粘膜水腫 ,粘膜皺褶增B 組小鼠氣道總管壁、內(nèi)壁、氣管平滑肌層均增厚（P<0.01,圖 1，2，表 1）。

.B 組小鼠氣道上皮脫落、受損 ,氣道壁不完整，支氣管周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌、氣道粘膜及基底膜增厚，，氣道內(nèi)見粘液栓 HE×200表 1.兩組小鼠氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較（ x±s，μm）組別 鼠數(shù) WAt/ Pbm WAi/ Pbm WAm/ PbmA 組 10 12.9±1.1 8.5±1.1 4.2±0.9B 組 10 17.0±1.4*10.4±1.0*6.1±1.0**P<0.01 vs A 組）、兩組小鼠 BALF 的細(xì)胞學(xué)變化B 組小鼠 BALF 中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均較對(duì)照組顯著升高<0.01，表 2）。表 2.兩組小鼠 BALF 的細(xì)胞學(xué)變化（ x±s）組別 鼠數(shù) 白細(xì)胞總數(shù)（×105）嗜酸粒細(xì)胞數(shù)（%）淋巴細(xì)胞數(shù)（%）
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R562.25

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