【摘要】：支氣管哮喘是一種呼吸系統(tǒng)的常見病,全球發(fā)病率、死亡率逐年增高。慢性氣道炎癥、氣道高反應(AHR)及氣道重建是哮喘主要特征。其中,氣道重建導致氣流不可逆的阻塞及持續(xù)氣道高反應,是哮喘治療變得困難的因素之一。因此,深入探討氣道重建的機制對發(fā)現(xiàn)新的、有效的哮喘治療方法具有重要意義。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),氧化應激、吸煙、過敏原、生長因子、細胞因子和炎癥介質(zhì)等多種因素參與了氣道重建,而EGFR活化發(fā)揮中心調(diào)節(jié)作用。EGFR及其配體在氣道重建中的作用復雜,進一步研究調(diào)節(jié)EGFR和配體活性機制,成為當今研究熱點。本課題建立小鼠慢性哮喘模型,觀察氣道結(jié)構(gòu)改變、肺組織EGFR表達變化、BALF中EGFR配體TGF-α濃度變化及地塞米松的干預;體外實驗,進一步觀察EGFR活化在TGF-α、IL-13、TNF-α促氣道平滑肌細胞增殖中的作用。以期為哮喘氣道重建的防治提供新思路。本課題分為五部分。 第一部分 慢性哮喘小鼠模型的建立 目的:建立小鼠慢性哮喘模型。方法:將OVA20μg加2.6mg氫氧化鋁溶于PH為7.4的PBS0.2ml中,于第0、7、14天給BALB/c小鼠腹腔注射;于第20天至第29天、第47天、第61天、第73天至第75天鼻腔內(nèi)滴入OVA抗原液100μg。常規(guī)病理切片觀察小鼠肺內(nèi)炎癥情況、氣管壁厚度及氣道平滑肌厚度。檢測BALF中細胞數(shù)。測定氣道對腺苷、乙酰膽堿的反應性。結(jié)果:OVA致敏、激發(fā)后小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣;氣管、支氣管及血管周圍大量炎癥細胞聚集;BALF中白細胞總數(shù)、嗜酸細胞及淋巴細胞均較對照組顯著升高(P0.01);氣管壁及氣道平滑肌增厚(P0.01);氣道對腺苷、乙酰膽堿的反應性增高(P0.01)。結(jié)論:用OVA致敏、激發(fā),可以成功建立小鼠慢性哮喘模型。 第二部分 慢性哮喘小鼠肺內(nèi)EGFR及其配體TGF-α的表達 目的:探討EGFR系統(tǒng)在慢性哮喘小鼠氣道重建中的作用。方法:建立慢性 WP=6 哮喘小鼠模型,ELISA法測定BALF中TGF-α的濃度,RT-PCR觀察小鼠肺部EGFR mRNA的表達,免疫組化及Western Blot觀察EGFR蛋白的表達。結(jié)果:慢性哮喘組小鼠BALF中TGF-α濃度、肺組織EGFR mRNA及EGFR蛋白的表達較正常對照組均增高(P0.01)。結(jié)論:慢性哮喘小鼠BALF中TGF-α的濃度、肺組織EGFR的表達增高。 第三部分TGF-α對小鼠氣道平滑肌細胞的促增殖作用及其機制 目的:探討TGF-α對小鼠ASMC促增殖作用及其機制。方法:分離和培養(yǎng)正常小鼠氣道平滑肌細胞。免疫組化觀察ASMC EGFR的表達。用四唑鹽(MTT)比色法和3H-TdR摻入法測定加入TGF-α ASMC增殖情況。采用3H-TdR摻入法和MTT法觀察AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin對TGF-α促ASM增殖的影響。用Western Blot方法測定加入不同濃度TGF-α、不同時間及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表達。結(jié)果:用MTT和3H-TdR摻入法測定ASMC培養(yǎng)液中加入TGF-α后ASMC增殖比對照組明顯增加,并呈時間和濃度依賴性(P0.01)。AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin抑制TGF-α促ASMC增殖(P0.01)。免疫組化顯示EGFR表達于ASMC 細胞膜上。經(jīng)Western Blot檢測,TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表達增高,并呈時間和濃度依賴性(P0.05)。AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表達的增加(P0.01)。結(jié)論:TGF-α激活EGFR為磷酸化EGFR,從而通過:1 ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑;2 PI3K-PKC-IKK途徑,促進體外培養(yǎng)的小鼠ASMC的增殖。 第四部分 EGFR在IL-13、TNF-α促小鼠氣道平滑肌細胞增殖中的作用 目的:探討EGFR在IL-13、TNF-α促體外培養(yǎng)小鼠ASMC增殖中的作用。方法:分離和培養(yǎng)正常小鼠ASMC。用臺盼藍染色計數(shù)分別加入IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α后,ASMC活細胞數(shù)。采用3H-TdR摻入法和MTT法觀察AG1478、225mAb、TGF-α中和抗體, EGF中和抗體, HB-EGF中和抗體對IL-13、TNF-α促ASMC增殖的影響。用ELISA法測定各組細胞培養(yǎng)上清液中TGF-α的濃度,RT-PCR檢測各組ASMC EGFR mRNA的表達,Western Blot檢測ASMC EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白的表達。結(jié)果:ASMC細胞數(shù)及3H-TdR摻入量,IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α組較對照組增多,IL-13+ TNF-α組增多最為明顯,IL-13組次之(P0.05)。IL-13、TNF-α組MTT值及3H-TdR摻入量均較對照組增高(P0.01),AG1478、 WP=7 225mAb抑制其增高(P0.01)。經(jīng)RT-PCR分析,TNF-α組EGFR mRNA的表達較對照組增加(P0.01)。經(jīng)Western Blot檢測,TNF-α組ASMC EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白的表達與對照組相比表達增強(P0.01),IL-13組ASMC磷酸化EGFR蛋白的表達與對照組相比表達增強(P0.01),加入AG1478、225mAb后抑制ASMC 磷酸化EGFR蛋白的表達的增加(P0.01)。IL-13+TGF-α中和抗體組、TNF-α+TGF-α中和抗體組MTT值及3H-TdR摻入量分別低于IL-13、TNF-α組。1h、3h IL-13組、TNF-α組細胞上清液中TGF-α量比對照組增加(P0.01)。結(jié)論:IL-13刺激ASMC分泌TGF-α,TGF-α與EGFR結(jié)合,EGFR活化,引起體外培養(yǎng)的小鼠ASMC的增殖。TNF-α刺激ASMC分泌TGF-α,及EGFR mRNA和蛋白表達,TGF-α與EGFR結(jié)合,EGFR活化,引起體外培養(yǎng)的小鼠氣道平滑肌細胞的增殖。 第五部分 地塞米松對慢性哮喘小鼠氣道重建及EGFR表達的影響 目的:地塞米松對慢性哮喘小鼠氣道重建及EGFR系統(tǒng)的影響。方法:建立小鼠慢性
【圖文】：

0%(Per為“舒張”狀態(tài)的Pe)。）、統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件，兩組間比用 t 檢驗， P<0.05 為有統(tǒng)計學意義。結(jié) 果）、一般情況觀察B 組小鼠經(jīng)OVA 抗原液激發(fā)后 ,出現(xiàn)張口喘息 ,腹部翕動 ,易激惹 ,煩躁不,且出現(xiàn)噴嚏頻頻 ,飲水增多。而對照組小鼠行動敏捷 ,未見異常。）、病理學變化及圖像分析B 組小鼠鏡下可見氣道周圍大量炎細胞浸潤，以嗜酸粒細胞、淋巴細胞為主，上皮受損 ,氣道壁不完整。氣道腔內(nèi)粘液分泌增多 ,粘膜水腫 ,粘膜皺褶增B 組小鼠氣道總管壁、內(nèi)壁、氣管平滑肌層均增厚（P<0.01,圖 1，2，表 1）。

.B 組小鼠氣道上皮脫落、受損 ,氣道壁不完整，支氣管周圍有大量炎細胞浸潤，氣道平滑肌、氣道粘膜及基底膜增厚，，氣道內(nèi)見粘液栓 HE×200表 1.兩組小鼠氣道形態(tài)學參數(shù)比較（ x±s，μm）組別 鼠數(shù) WAt/ Pbm WAi/ Pbm WAm/ PbmA 組 10 12.9±1.1 8.5±1.1 4.2±0.9B 組 10 17.0±1.4*10.4±1.0*6.1±1.0**P<0.01 vs A 組）、兩組小鼠 BALF 的細胞學變化B 組小鼠 BALF 中白細胞總數(shù)、嗜酸細胞及淋巴細胞均較對照組顯著升高<0.01，表 2）。表 2.兩組小鼠 BALF 的細胞學變化（ x±s）組別 鼠數(shù) 白細胞總數(shù)（×105）嗜酸粒細胞數(shù)（%）淋巴細胞數(shù)（%）
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R562.25

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 袁天柱;楊鯤鵬;壽化山;韋武利;陳衛(wèi)民;王奇;;肌肉非損傷性開胸氣道重建治療中心型NSCLC[J];中國醫(yī)藥科學;2011年13期

2 李冀;謝田;于海;蔣蕾;趙偉國;趙雪瑩;畢s

本文編號：2625964