【摘要】： 一.研究背景 氣道重塑是支氣管哮喘基本特征之一,將氣道炎癥和氣道高反應性聯(lián)系起來。氣道重塑指的是哮喘中發(fā)生于氣道壁的結(jié)構(gòu)改變,這些改變包括上皮細胞的增生和化生,上皮下纖維化,肌細胞增生和血管發(fā)生。而氣道平滑肌細胞(airwaysmooth muscle cell,ASMC)是氣道重塑的主要結(jié)構(gòu)成分之一。哮喘時ASMC生物學特性發(fā)生很大變化,包括增生,肥大,遷移等,不僅使支氣管對刺激的收縮反應更強烈,加重氣道高反應性,而且增殖的ASMC使氣道壁增厚,導致基礎氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。遺憾的是,當前尚無可以阻止或逆轉(zhuǎn)氣道重塑和其對肺功能影響的有效治療。因此迫切需要深入了解氣道重塑時ASMC的增殖和遷移等機制,尋找抑制其增殖和遷移等的靶點,為尋找新的阻止甚至逆轉(zhuǎn)氣道重塑的藥物提供理論和實驗依據(jù)。 與張力蛋白和輔助蛋白同源,第10號染色體丟失的磷酸酶基因(phophataseand tensin homolog deleted on chromosone 10,PTEN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因,是至今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,對細胞的生長、增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等許多生物學行為有重要影響。隨著研究的深入人們也發(fā)現(xiàn)其在非腫瘤性疾病,如:心肌肥大,高血壓動脈粥樣硬化,支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。 已有的研究已經(jīng)證實PTEN可以通過對PI3K,ERK和FAK等通路的抑制來抑制腫瘤細胞,心肌和血管平滑肌等細胞的增殖,而這些通路同時也是介導ASMC增殖,遷移等的主要信號傳導通路,PTEN對ASMC的增殖等是否也有類似地影響,目前尚無相關(guān)的報道。我們推斷PTEN的過表達對HASMC可能也具有類似的抑制增殖作用。 二.研究目的 通過攜帶野生型PTEN全長cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞(Human Airway Smooth Muscle Cell,HASMC),實現(xiàn)PTEN的過表達,以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和正常組作為對照,初步研究PTEN的過表達對HASMC增殖和細胞周期進展的影響。 三.材料和方法 1、分離肺癌肺葉切除術(shù)患者切除的相對正常的肺組織中的小支氣管,按照本實驗室已經(jīng)成熟的方法培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞,4～8代的氣道平滑肌細胞用于實驗。用抗平滑肌a—肌動蛋白單克隆抗體鑒定為人氣道平滑肌細胞。 2、攜帶野生型PTEN cDNA的質(zhì)粒(p-WT-PTEN)和空載質(zhì)粒(p-EGFP)轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5a中擴增。氨芐青霉素篩選,挑選陽性克隆,搖菌,Omega公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,雙酶切,及基因測序鑒定正確后,大量提取質(zhì)粒,-20℃保存?zhèn)溆谩?3、實驗分組:將細胞分為3組:轉(zhuǎn)染p-WT-PTEN質(zhì)粒組(A組)、轉(zhuǎn)染空載體p-EGFP組(B組)、正常對照組(C組)。參照Lipofectamin2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒步驟進行操作,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。 4、MTS/PMS微量比色法檢測各組HASMC的增殖。 5、各組細胞PI單染后流式細胞儀測定細胞周期分布。 6、Trizol提取總RNA,RT-PCR檢測各組細胞PTENmRNA的表達。 7、免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)染后各組HASMC PTEN蛋白的表達并拍照。 8、所有原始數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,應用SPSS11.5軟件進行One WayANOVA(LSD)統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 四.結(jié)果 1、ASMC未匯合之前多呈梭形或多邊形,內(nèi)有1-2個細胞核,可向細胞密度低的方向伸出一至數(shù)個足突。細胞匯合后部分區(qū)域細胞束狀排列,呈典型“峰谷”狀。對平滑肌細胞特異的a-肌動蛋白進行免疫細胞化學染色,免疫反應陽性產(chǎn)物呈棕黃色。傳至第4代,平滑肌純度為95%。 2、少量制備的質(zhì)粒,經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ酶切后,瓊脂糖凝膠電泳,可顯示兩條條帶,分子量分別為5.4kb、1.3 kb,與pGZdXZ和插入的PTEN基因的大小一致。提取的質(zhì)粒送北京諾賽公司測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST與Genebank序列完全相符。 3、倒置熒光顯微鏡下,見質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染ASMC,轉(zhuǎn)染陽性細胞在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光。 4、MTS/PMS法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HASMCs增殖的影響,結(jié)果顯示p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組細胞的吸光度(OD490值)顯著低于p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組(P＜0.05);而p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 5、流式細胞儀檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HASMCs細胞周期的影響,p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組G_0/G_1期細胞的比例顯著大于空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組,S期及G_2/M期細胞的比例顯著少于p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組(P＜0.05),p-EGFP轉(zhuǎn)染組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 6、RT-PCR同時擴增p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組,p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組PTENmRNA,結(jié)果顯示p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染組PTEN mRNA的表達顯著比p-EGFP轉(zhuǎn)染組及對照組PTEN mRNA的表達增加。 7、轉(zhuǎn)染48小時各組HASMC PTEN蛋白免疫組化結(jié)果顯示,PTEN蛋白在p-WT-PTEN轉(zhuǎn)染陽性HASMC胞漿和胞核均有明顯表達,且胞核表達比胞漿多,而p-EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組僅見微弱的PTEN蛋白表達。 五.結(jié)論 1、PTEN在HASMC中具有與在其他細胞中類似的抑制增殖的作用,外源PTEN的表達能夠抑制HASMC的增殖和細胞周期進展,G_0/G_1期細胞的比例增大,而S期及G_2/M期細胞的比例減少。 2、p-WT-PTEN成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)地HASMC后,PTEN在mRNA和蛋白水平表達增加。
【圖文】：

p一WT-PTEN和p一EGFP的中一，雙酶切電泳圖Figurel:SingleanddoubledigestionofP一WT-PTENandP一EGFPMarkerlanel，5:P一WT-PTENandP一EGFPwithoutrestrieteddigest

5.p一wT-PTEN，p一EGFP轉(zhuǎn)染HAsMC48小時后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染后48小時在倒置熒光顯微鏡卜觀察轉(zhuǎn)染效果，鏡卜可見轉(zhuǎn)染陽性細胞有綠色熒光蛋白表達，，如圖3一1，3一2，表明質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)染HASMC。圖3一}:p一wT-PI，EN車專染組圖3一2:p一EGI:P轉(zhuǎn)染組 F193一 1HASMCtrans比 etedwitt1P一WT-P『 fENFig3一 2HASMCtransfectedwithP一EGFP6.MTS/PMS法檢測轉(zhuǎn)染后各組 HASMCOD490p一WT-pTEN和p一EGFp轉(zhuǎn)染后48小11寸各組HAsMe的oD49o女l一表2所示，p一wT-PTEN轉(zhuǎn)染組HASMC的增殖受到抑制，，、p一 EcFP轉(zhuǎn)染組和對照組相比差異具有統(tǒng)訓‘學意義(爪0.05)，p一EGFP轉(zhuǎn)染組和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。2l
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R562.25

【共引文獻】

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本文編號：2609164