【摘要】： 實驗背景在結(jié)核病高疫情國家,結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液最常見原因,結(jié)核性胸膜炎診斷的金標準為胸液結(jié)核分枝桿菌檢測,但陽性率低。顯微鏡觀察的藥敏試驗法、噬菌體生物擴增法等病原學診斷技術,PCR、核酸探針等分子生物學技術雖得到快速發(fā)展,但對結(jié)核性胸膜炎的診斷仍受敏感度、特異度的限制。胸膜活檢或胸腔鏡檢查均為有創(chuàng)性檢查,不能常規(guī)應用。酶聯(lián)免疫斑點技術(enzyme-linked immunospot assay ,ELISPOT)是近年來興起的檢測細胞免疫功能的一種方法,其檢測的是經(jīng)抗原刺激后分泌細胞因子的效應T淋巴細胞的數(shù)量,此方法靈敏穩(wěn)定,已被越來越廣泛的應用于醫(yī)學研究中。其在結(jié)核病診斷方面主要集中在應用結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼的早期分泌抗原靶(early secreting antigen target 6KD ,ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(culture filtrate protein 10KD ,CFP-10)及其多肽作為抗原,對活動性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染者的外周血單個核細胞的研究,有較高的敏感度和特異度。結(jié)核性胸膜炎胸腔局部的隔室化反應證實胸液中細胞因子檢測較外周血對診斷更有意義。本研究應用ELISPOT方法,檢測胸腔積液單個核細胞(pleural effusion mononuclear cells,PEMC)經(jīng)結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼的蛋白刺激后,分泌IFN-γ的特異性T淋巴細胞,探討其在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值。 實驗方法本實驗選取研究對象共98例,其中結(jié)核性胸腔積液患者55例,惡性胸腔積液患者43例。收集患者胸液提取單個核細胞(pleural effusion mononuclear cells ,PEMC)進行凍存,再復蘇細胞并與ESAT-6及經(jīng)誘導表達、純化出的ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10、Rv3873和Rv3879c蛋白共同孵育,進行ELISPOT試驗,檢測經(jīng)抗原刺激后分泌IFN-γ的效應T淋巴細胞(即斑點形成細胞,SFC)的數(shù)量。 實驗結(jié)果ESAT-6 ELISPOT、ESAT-6/CFP-10融合蛋白ELISPOT、CFP-10 ELISPOT、Rv3873 ELISPOT和Rv3879c ELISPOT的SFC數(shù)量在結(jié)核性胸腔積液組中顯著高于惡性胸腔積液組;抗原ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10的ELISPOT結(jié)果對結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度無顯著差異,分別為:90.9%、98.2%、89.1%,而Rv3873和Rv3879c對結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度較低,分別為78.2%和72.7%,兩者無顯著性差異�？乖璄SAT-6、ESAT-6/CFP-10融合蛋白、CFP-10、Rv3873和Rv3879c的ELISPOT結(jié)果對結(jié)核性胸膜炎診斷的特異度總體差異無統(tǒng)計學意義,分別為:95.3%、83.7%、86.1%、76.7%和95.3%,而經(jīng)兩兩比較后得到五種抗原診斷結(jié)核性胸膜炎的特異度差異無統(tǒng)計學意義�？傮w考慮ESAT-6 ELISPOT相對于所選抗原有更高的應用價值。總體考慮ESAT-6 ELISPOT相對于所選抗原有更高的應用價值。 結(jié)論以RD1區(qū)編碼的蛋白作為結(jié)核特異性抗原刺激胸腔積液患者的PEMC的ELISPOT檢測技術是一種較為敏感和特異的方法,可為結(jié)核性和惡性積液的鑒別診斷提供參考價值。
【圖文】：

合、CFP-10、Rv3873 和 Rv3879c 作為抗原在大腸桿菌 BL21 (DE3)中的誘導表達和純化、定量(一) SDS－PAGE 電泳檢測蛋白的誘導表達及純化以重組表達質(zhì)粒: pET-30a(+):CFP-10 蛋白轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 1.0 mmol/ L IPTG ℃誘導 3 h 和 pET-28a(+):ESAT-6/CFP-10 融合蛋白轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 1.0 mmol/ L IPTG ℃誘導 4 h 后做 12%SDS-PAGE 電泳可見特異性表達帶, 重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為 11000 和 18000 Da（圖 1A 和圖 1B）；以重組表達質(zhì)粒: pET30a(+):rv3873 轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌0.4 mmol/ L IPTG 30℃誘導 4 h 和 pET30a(+):rv3879c 轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 0.4 mmol/ L IP30℃誘導 5 h 后做 10%SDS-PAGE 電泳可見特異性表達帶, 重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為 47000 和 87000 Da（圖 2A 和圖 2B）。

合、CFP-10、Rv3873 和 Rv3879c 作為抗原在大腸桿菌 BL21 (DE3)中的誘導表達和純化、定量(一) SDS－PAGE 電泳檢測蛋白的誘導表達及純化以重組表達質(zhì)粒: pET-30a(+):CFP-10 蛋白轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 1.0 mmol/ L IPTG ℃誘導 3 h 和 pET-28a(+):ESAT-6/CFP-10 融合蛋白轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 1.0 mmol/ L IPTG ℃誘導 4 h 后做 12%SDS-PAGE 電泳可見特異性表達帶, 重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為 11000 和 18000 Da（圖 1A 和圖 1B）；以重組表達質(zhì)粒: pET30a(+):rv3873 轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌0.4 mmol/ L IPTG 30℃誘導 4 h 和 pET30a(+):rv3879c 轉(zhuǎn)化的 BL21 (DE3) 菌經(jīng) 0.4 mmol/ L IP30℃誘導 5 h 后做 10%SDS-PAGE 電泳可見特異性表達帶, 重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為 47000 和 87000 Da（圖 2A 和圖 2B）。
【學位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R446.6;R521.7

【參考文獻】

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本文編號：2608219