【摘要】：研究背景 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見(jiàn)的以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病,氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展。與氣道和肺臟對(duì)有毒顆�；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告,COPD是全球第三大死亡原因,2015年死亡人數(shù)達(dá)320萬(wàn)。COPD疾病的發(fā)生發(fā)展及其死亡率增加主要與吸煙有關(guān)。研究顯示下呼吸道免疫細(xì)胞的功能降低使得病原體定植機(jī)率升高,從而促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展~([1])。肺泡巨噬細(xì)胞作為下呼吸道免疫細(xì)胞的主要成員,其在COPD病程中吞噬下呼吸道病原體的能力減弱已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可~([2])。研究指出香煙煙霧的成分會(huì)通過(guò)促進(jìn)肥大細(xì)胞表達(dá)蛋白酶絲氨酸成員S31(Prss31)促使肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar Macrophages,AM)的浸潤(rùn),并向M2型極化,促進(jìn)COPD疾病的進(jìn)展并且香煙煙霧會(huì)誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞自噬~([3])。因此尋找相應(yīng)的抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)抗香煙引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而改善肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能可作為治療COPD一個(gè)新的研究方向。Nrf2-ARE通路是經(jīng)典的抗氧化應(yīng)激通路,但激活Nrf2-ARE通路能否修復(fù)香煙煙霧作用下肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞內(nèi)的活性氧目前尚不明確。因此,本研究探討Nrf2-ARE信號(hào)通路途徑在肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的金黃色葡萄球菌的吞噬作用。研究目的 探討Nrf2-ARE通路的激活是否能修復(fù)香煙刺激后肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能及抗氧化應(yīng)激作用。研究方法 1、細(xì)胞培養(yǎng):大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)使用含20%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的F-12K進(jìn)行培養(yǎng)。2、香煙提取物的制備:點(diǎn)燃香煙提取物裝置上的香煙。運(yùn)用50ml注射器抽吸產(chǎn)生的負(fù)壓作用將3支香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧溶于20ml的F-12K培養(yǎng)液中。3、藥物和香煙提取物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的干預(yù):設(shè)立空白對(duì)照組:普通培養(yǎng)基處理16h+24h。CSE刺激組:普通培養(yǎng)基處理16h+香煙提取物處理24h。藥物干預(yù)組:2.5μmol/L的蘿卜硫素和20μmol/L特丁基對(duì)苯二酚(tert-Butylhydroquinone,T-BHQ)處理16h+香煙提取物處理24h。4、肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè):運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的差異。5、肺泡巨噬細(xì)胞活性氧的檢測(cè):運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組肺泡巨噬細(xì)胞的活性氧。6、免疫印跡法檢測(cè)各組肺泡巨噬細(xì)胞核蛋白Nrf2的表達(dá)水平差異。7、細(xì)胞毒性的檢測(cè):運(yùn)用CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)檢測(cè)藥物及香煙提取物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的毒性影響。研究結(jié)果 (1)與空白組相比,經(jīng)香煙提取物刺激的肺泡巨噬細(xì)胞其吞噬功能明顯下降(7001.66±559.47 VS 1508±349.6,P0.05)。(2)運(yùn)用Nrf2-ARE通路的激活劑:蘿卜硫素2.5μmol/L和特丁基對(duì)苯二酚20μmol/L干預(yù)后可明顯減緩香煙刺激引起的肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的降低(3034±272;;2753±160.1,P0.05)并降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧(67.93%±2.05%)VS(38.53%±1.22%)/(34.03%±2.27%),P0.05)。(3)Western印跡技術(shù)證實(shí)干預(yù)16h后,特丁基對(duì)苯二酚及蘿卜硫素可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞Nrf2的核蛋白表達(dá)(0.87±0.06)VS(2.12±0.03)/(2.80±0.06)。(P0.05)。(4)在香煙提取物作用下,肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能與Nrf2核蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.93,P0.05)。肺泡巨噬細(xì)胞活性氧含量與Nrf2核蛋白的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.942,P0.05),肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能與細(xì)胞內(nèi)活性氧含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.883,P0.05)。研究結(jié)論 Nrf2-ARE通路的激活可減緩香煙提取物刺激引起的肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能下降并具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。
【圖文】：

1 研究設(shè)計(jì)與方法本實(shí)驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)及 Pearson 相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。使用含 20%胎牛血清和 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的 F-12K 進(jìn)行培養(yǎng)進(jìn)行肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）的細(xì)胞培養(yǎng)。設(shè)立實(shí)驗(yàn)分組（空白對(duì)照組、香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激組、蘿卜硫素干預(yù)組及特丁基對(duì)苯二酚干預(yù)組），運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀察吞噬情況，流式細(xì)胞儀分析吞噬功能和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表達(dá)情況。運(yùn)用 Western 印跡技術(shù)分析經(jīng)藥物干預(yù) 16h 后 Nrf2 核蛋白在肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。2 研究方法及流程2.1 研究流程

圖 2 肺泡巨噬細(xì)胞在 200×顯微鏡下的形態(tài)素和特丁基對(duì)苯二酚可上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞 Nrf2 核蛋Western 印跡技術(shù)分析經(jīng)藥物干預(yù) 16h 后 Nrf2 核蛋白在肺泡巨n=3)（圖 3）：各組 Nrf2/GAPDH 相對(duì)灰度值分別為：正常對(duì)香煙提取物組：（1.48±0.07）蘿卜硫素組：（2.12±0.03），2.80±0.06）。特丁基對(duì)苯二酚和蘿卜硫素處理 16h 后核蛋白異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Dhulfiqar Ali Abed;Melanie Goldstein;Haifa Albanyan;Huijuan Jin;Longqin Hu;;Discovery of direct inhibitors of Keap1 Nrf2 protein protein interaction as potential therapeutic and preventive agents[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年04期

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本文編號(hào)：2606808