發(fā)布時(shí)間：2020-03-27 18:05

【摘要】：目的 支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的慢性呼吸道炎癥性疾病,是支氣管平滑肌痙攣和支氣管粘膜炎癥所致的以小氣道阻塞為主要特征的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性疾病。雖然對哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療的研究有很大進(jìn)展,但哮喘的發(fā)病率、患病率和死亡率仍呈上升趨勢。尋求對這類疾病的防治方法,一直是醫(yī)學(xué)界探索的重要課題。因此,為找到有效的防治方法,人們從各種角度去探討哮喘的發(fā)病機(jī)理。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System)是人體生理功能的一個(gè)重要神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中最主要的效應(yīng)分子,它主要通過作用于血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R),在循環(huán)系統(tǒng)或組織局部發(fā)揮收縮血管、調(diào)節(jié)血流、維持機(jī)體水鹽代謝和促進(jìn)組織細(xì)胞增殖的作用。除了上述作用,在機(jī)體病理狀態(tài)下,AngⅡ在局部組織中還有重要的促炎作用。它可以調(diào)節(jié)炎癥趨化因子、細(xì)胞因子和黏附分子等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá),促使炎癥細(xì)胞聚集,參與機(jī)體炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此,RAS除了在心血管方面的調(diào)節(jié)功能以外,其與肺臟疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的關(guān)系也已逐漸引起人們的重視。目前,雖然有報(bào)道認(rèn)為RAS在哮喘疾病發(fā)生過程被激活,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果只集中在RAS中的ACE與AngⅡ等方面的研究,不能解釋哮喘機(jī)制研究中的某些現(xiàn)象。 糜酶(chymase)主要是由肥大細(xì)胞分泌的中性蛋白酶,在多種組織器官炎癥性疾病中參與作用。糜酶抑制劑除了可以抑制病變部位肥大細(xì)胞的聚集,還能有效抑制心肌梗死后心功能惡化、降低死亡率,并能降低動靜脈內(nèi)瘺以及人工血管移植后血管內(nèi)狹窄的發(fā)生。隨著實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展,我們發(fā)現(xiàn),決定AngⅡ生成的調(diào)控機(jī)制,為理解RAS在肺疾病發(fā)生機(jī)制方面提供了新思路和新方法。有研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)不僅可以由經(jīng)典途徑的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)催化生成AngⅡ,糜酶作為另一條途徑也可以催化AngⅠ生成AngⅡ。在哮喘發(fā)病過程中,以呼吸道慢性炎癥性改變?yōu)橹?其中可以看到大量肥大細(xì)胞參與整個(gè)氣道炎癥過程。有研究證實(shí)糜酶與呼吸系統(tǒng)疾病如肺臟組織纖維化等有關(guān),但其與哮喘疾病的相關(guān)性還未見研究報(bào)道。因此我們推測,糜酶是否通過調(diào)節(jié)RAS,加重哮喘疾病過程中的炎癥改變,在哮喘疾病發(fā)病過程中可能發(fā)揮一定的作用。 因此,本實(shí)驗(yàn)制備BALB/c小鼠哮喘模型,應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)和血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑(坎地沙坦),分別阻斷RAS活化的不同途徑,減少AngⅡ生成或拮抗其與AT1R結(jié)合；利用糜酶抑制劑(Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2),以糜酶為靶點(diǎn),觀察小鼠哮喘時(shí)肺組織RAS系統(tǒng)相關(guān)組分蛋白及基因表達(dá)改變,以及肺臟組織形態(tài)學(xué)改變,進(jìn)一步探討RAS在哮喘發(fā)病過程中的作用。 方法 1.小鼠哮喘動物模型的制備及藥物處理 BALB/c小鼠80只,雌性,體重18-22g,隨機(jī)分為8組：①對照組(A),②模型組(B),③卡托普利低劑量組(C),④卡托普利高劑量組(D),⑤坎地沙坦低劑量組(E),⑥坎地沙坦高劑量組(F)⑦Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2低劑量組(G),⑧Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2高劑量組(H)。除對照組小鼠外,其他7組小鼠從0、7、14天開始致敏,即腹腔注射混合液200ul/只(卵白蛋白(OVA)100ug/只,氫氧化鋁凝膠2.25mg/只)。從第21天開始,連續(xù)七天霧化吸入5%OVA30min。觀察小鼠,以煩躁不安,呼吸急促、腹肌抽搐、兩便失禁等反應(yīng),作為判斷模型動物癥狀陽性的指標(biāo)。除對照組和模型組外,其他6組小鼠在霧化吸入開始前一天,每天灌胃相應(yīng)劑量的各組藥物,霧化吸入7天結(jié)束后,各組小鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,分別留取血清、肺組織等標(biāo)本。 2.HE染色和透射電鏡觀察各組小鼠肺臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,觀察哮喘肺組織炎癥浸潤和結(jié)構(gòu)破壞。 3.免疫組織化學(xué)染色觀察RAS中ACE、ACE2、AT1R、血管緊張素Ⅱ2型受體(AT2R)和糜酶等相關(guān)蛋白在哮喘肺組織中的表達(dá)變化。 4. Western-blot法檢測各組肺組織中RAS相關(guān)蛋白和NF-κB(p65和p50)的表達(dá)改變。 5. RT-PCR檢測各組肺組織中AGT, AT1R,AT2R和ACE等RAS相關(guān)基因表達(dá)的改變,分析哮喘疾病過程中相關(guān)基因表達(dá)及阻斷RAS活化后,其變化的趨勢。 6.采用放免法測定AngⅠ及AngⅡ的含量,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行 結(jié)果 1.肺組織形態(tài)學(xué)改變。 肺組織HE染色結(jié)果可見：與對照組相比,模型組肺組織切片可見支氣管周圍及血管旁有嗜酸性粒細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,氣道上皮破壞,黏膜下水腫,支氣管壁增厚,氣道平滑肌增生,末梢肺泡組織過度充氣等不同程度的炎性改變�？ㄍ衅绽M、坎地沙坦組及Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2組細(xì)支氣管及血管周圍肺臟組織中炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕,黏膜上皮細(xì)胞脫落也有所改善,氣道平滑肌痙攣、增厚和末梢肺泡組織氣腫改變明顯減輕。 肺組織透射電鏡結(jié)果可見：與對照組肺組織切片相比,模型組肺組織可見肺泡壁變薄,末梢肺泡過度充氣；肺泡腔內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增多,肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目增多,肺泡壁和肺泡腔都有巨噬細(xì)胞分布,而且在較大的氣管周圍,肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多；肺泡壁Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量減少,體積變小,嗜鋨性板層小體減少,胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體,細(xì)胞表面微絨毛減少；肺泡隔內(nèi)Ⅰ型上皮細(xì)胞脂滴減少�？ㄍ衅绽蛣┝拷M肺組織可見部分肺泡壁薄,結(jié)構(gòu)不完全,肺泡腔內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多,線粒體腫脹；Ⅰ型肺泡細(xì)胞狀態(tài)較好,Ⅱ型肺泡細(xì)胞在肺泡壁薄的地方數(shù)目減少�？ㄍ衅绽邉┝拷M肺組織可見,Ⅰ,Ⅱ型肺泡細(xì)胞較好,肺泡腔內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞減少�？驳厣程沟蛣┝拷M肺組織可見肺泡壁炎癥細(xì)胞增多,毛細(xì)血管閉塞,局部肺泡腔呈充血狀；Ⅰ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,Ⅱ型肺泡細(xì)胞胞質(zhì)略致密,板層小體減少；肺泡隔內(nèi)中性粒細(xì)胞增多,肺泡腔內(nèi)可見較多巨噬細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞。坎地沙坦高劑量組肺組織可見Ⅰ、Ⅱ肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常,Ⅰ型細(xì)胞胞質(zhì)略致密,大部分Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,個(gè)別細(xì)胞胞質(zhì)輕度致密,板層小體減少,肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2低劑量組和高劑量組透射電鏡結(jié)果可見,隨著治療劑量的增加,肺泡壁Ⅰ、Ⅱ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量趨于正常,肺泡腔內(nèi)和間質(zhì)中浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量較哮喘模型組明顯減少,肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞減輕。 2.AT1R免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對照組肺組織我們可見AT1R少量陽性表達(dá),主要分布在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜表面和胞漿中,局部組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。模型組中AT1R陽性表達(dá)較對照組增加,肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)也有明顯陽性表達(dá),支氣管壁周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯增多,管腔內(nèi)可見脫落肺泡上皮細(xì)胞。Suc-Val-Pro-L-Phep(OPh)2組,卡托普利組和坎地沙坦組可以看到,隨著各組藥物劑量增加,AT1R陽性表達(dá)較模型組明顯降低,肺組織炎癥浸潤明顯減輕,支氣管壁厚度明顯小于模型組。 ACE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對照組肺組織中肺泡壁上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中均有少量ACE陽性表達(dá),模型組ACE陽性表達(dá)較對照組明顯增加�？ㄍ衅绽M隨著藥物劑量增加,ACE陽性表達(dá)較模型組明顯減少�？驳厣程菇M與Suc-Val-Pro-L-Phep(OPh)2組ACE陽性表達(dá)與模型組比較未見明顯變化趨勢。 Chymase免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對照組chymase未見明顯陽性表達(dá),模型組在肺泡上皮細(xì)胞,細(xì)支氣管及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均可見chymase陽性表達(dá),較對照組明顯增加,肺泡腔變窄,炎癥細(xì)胞浸潤增加�？ㄍ衅绽M與坎地沙坦組隨著藥物劑量增加,chymase陽性表達(dá)逐漸減少,局部組織炎癥浸潤明顯減輕。糜酶抑制劑組這種變化趨勢更加明顯,Suc-Val-Pro-L-Phep(OPh)2高劑量組可以明顯抑制糜酶在肺組織中的表達(dá)。 AT2R和ACE2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,在各組肺組織中,二者均未見明顯陽性表達(dá),各組間無明顯變化趨勢。 3. Western blot檢測各組肺組織RAS相關(guān)蛋白的變化。 Western blot顯示,模型組AT1R,ACE, chymase表達(dá)較對照組均明顯增加,卡托普利組隨著藥物治療劑量增加,上述三種蛋白表達(dá)與模型組比較明顯降低,AT2R和ACE2蛋白表達(dá)在各組間未見明顯變化趨勢�？驳厣程菇M隨著藥物劑量增加,AT1R和chymase表達(dá)與模型組比較明顯降低,而AT2R、ACE和ACE2蛋白表達(dá)在各組間未見明顯變化趨勢。Suc-Val-Pro-L-Phep(OPh)2組隨著藥物劑量增加,AT1R和chymase蛋白表達(dá)較模型組比較明顯降低,AT2R、ACE和ACE2蛋白表達(dá)在各組間未見明顯變化趨勢。NF-κB亞單位p65和p50在模型組中表達(dá)較對照組均明顯增加,應(yīng)用糜酶抑制劑Suc-Val-Pro-L-Phep(OPh)2后,二者在肺組織中的表達(dá)較模型組明顯降低。 4. RT-PCR檢測各組肺組織RAS相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化。 RT-PCR結(jié)果可見,在模型組,ACE mRNA表達(dá)較對照組明顯增加,應(yīng)用ACE抑制劑后,其表達(dá)較模型組明顯降低,AT1R阻滯劑和糜酶抑制劑對其表達(dá)無明顯影響。模型組AT1R mRNA表達(dá)較對照組明顯增加,應(yīng)用ACE抑制劑和AT1R阻滯劑后,其表達(dá)較模型組均明顯降低,糜酶抑制劑對AT1R mRNA表達(dá)無明顯影響。模型組AT2R mRNA的表達(dá)較對照明顯降低,分別阻斷ACE. AT1R和chymase后,均可使AT2R mRNA表達(dá)明顯增加。AGT mRNA表達(dá)在各組間未見明顯變化趨勢。 5.各組小鼠血清中AngⅡ與AngⅠ的含量變化 本實(shí)驗(yàn)小鼠血清中AngⅡ與AngⅠ結(jié)果顯示,模型組小鼠血清AngⅡ含量明顯高于對照組,卡托普利組與Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2組的小鼠血清AngⅡ含量與模型組比較明顯降低�？驳厣程菇M血清AngⅡ含量與模型組比較未見明顯變化趨勢。各組血清中AngⅠ的含量未見明顯差異。 結(jié)論 通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論： 1.肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞,證明通過OVA腹腔注射致敏后再霧化吸入5%OVA,可以成功復(fù)制小鼠哮喘動物模型,并且是一種比較理想的哮喘動物模型。 2.在小鼠哮喘發(fā)病過程中,RAS激活,其相關(guān)組分AngⅡ、ACE、AT1R和chymase等參與了哮喘肺組織的炎癥過程,并加重局部炎癥反應(yīng)。AT2R在哮喘時(shí)可能起到對抗AT1R的作用,保護(hù)肺組織,減輕其炎癥反應(yīng)。 3.哮喘時(shí),通過抑制RAS活化,減少AngⅡ生成,減輕了肺組織炎癥反應(yīng),進(jìn)而可能使肥大細(xì)胞減少,下調(diào)了糜酶的表達(dá)。 4.哮喘時(shí),升高的AngⅡ與AT1R結(jié)合,激活胞漿內(nèi)NF-κB,促其入核,轉(zhuǎn)錄合成大量促炎癥釋放因子,加重肺組織局部的炎癥反應(yīng)。抑制ACE、chymase和拮抗AT1R,能夠減輕肺組織炎癥變化。 5.哮喘時(shí)chymase參與了RAS的激活,其作為RAS新成員,通過催化AngⅡ生成,成為哮喘疾病過程中的另一個(gè)重要促炎因素。糜酶抑制劑一方面可以通過抑制糜酶催化活性,使AngⅡ生成減少,減少NF-κB活化,同時(shí)也可能通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞,抑制其脫顆粒作用,減輕哮喘肺組織的炎癥變化。 因此,本研究成功復(fù)制小鼠哮喘模型,應(yīng)用糜酶抑制劑抑制RAS激活,減輕小鼠哮喘模型肺組織炎癥改變,闡明了糜酶與RAS在哮喘發(fā)病過程中的作用,即糜酶可能通過活化RAS,催化AngⅡ生成,參與了哮喘發(fā)病。這為臨床研究和治療哮喘疾病以及開發(fā)有效的治療藥物提供了重要的理論依據(jù),使糜酶抑制劑有望成為治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的一類新的藥物。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2603194