【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的臨床發(fā)病率和病死率均較高,目前臨床各種治療手段尚未能使其病死率明顯下降。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷為研究對象,探討通過imipramine抑制應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)酰胺生成的關(guān)鍵酶酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase, ASMase)是否對急性肺損傷具有保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展的重要病理過程,本課題就imipramine對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中肺組織炎癥反應(yīng)和肺組織細(xì)胞凋亡的兩方面的影響進(jìn)行研究并探討相關(guān)分子機(jī)制,為通過調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺的生成治療急性肺損傷提供一定的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 采用LPS腹腔注射的方法誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的動物模型,并在LPS誘導(dǎo)前30min給予imipramine干預(yù),按照處理方式的不同分為四組：Sham+imipramine, Sham+vehicle, LPS+ imipramine和LPS+vehicle。記錄生存時(shí)間,計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組的生存率；觀察不同時(shí)間點(diǎn)不同實(shí)驗(yàn)組中急性肺損傷各指標(biāo)(肺組織病理學(xué)變化、W／D(Wet/Dry,濕干重比)、MPO (myeloperoxidase,髓過氧化物酶)、肺組織炎癥因子mRNA表達(dá)、支氣管肺泡灌洗液和血清中炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的指標(biāo)(Bcl-2和Bax蛋白含量)的變化；通過對NF-κB (nuclear factor kappa B,核因子kappa B)活性和含量、p38、JNK和Txnip (thioredoxin-interacting protein,硫氧還蛋白反應(yīng)蛋白)蛋白表達(dá)的檢測,進(jìn)一步探討imipramine抑制小鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)和凋亡的分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.腹腔注射LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷,其模型容易復(fù)制,肺損傷程度較穩(wěn)定、均勻,肺組織病理變化也證實(shí)符合小鼠急性肺損傷的病理改變。 2.在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷前30min給予小鼠imipramine干預(yù)可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存率(P0.05)。 3.肺組織病理學(xué)改變及評分：imipramine的應(yīng)用改善了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織的病理損傷,并且通過肺組織損傷病理評分,我們發(fā)現(xiàn)imipramine干預(yù)在12h(9.65±0.43VS11.9±0.80,P0.05)、18h(11.05±0.73VS14.30±0.39,P0.05)顯著降低了急性肺損傷小鼠肺組織病理損傷評分。這表明imipramine可以減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理損傷。 4.肺組織W／D：LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后,肺組織W／D增加,12h達(dá)到高峰5.24±0.11。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織W／D在6h(4.80±0.04VS5.16±0.05,P0.05)、12h(4.87±0.11VS5.24±0.11,P0.05)和18h(4.77±0.07VS5.14±0.03,P0.05)均顯著降低。 5.肺組織MPO活性：LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后,肺組織MPO活性增加,18h達(dá)到高峰37.55±5.67Units/min/mg protein。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織MPO活性在12h(10.10±1.28 Units/min/mg protein VS28.48±7.53 Units/min/mg protein, P0.05)和18h (11.39±1.36 Units/min/mg protein VS37.55±5.67 Units/min/mg protein, P0.05)均顯著降低。 6.支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度：TNF-a和IL-10在6h的基礎(chǔ)水平分別是218.50±22.11pg/ml,和83.02±15.33pg/ml。LPS刺激后TNF-a和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達(dá)到最高峰,分別為3860.31±274.80pg/ml和2809.00±143.70pg/ml。Imipramine干預(yù)在6h和12h顯著降低了TNF-α(6h：2204.00±242.30VS3860.31±274.80,12h：2236.00±348.0VS3612.00±412.70, P0.05)和IL-10 (6h：1645.00±222.50VS2809.00±143.70,12h：1463.00±137.80VS2117.00±117.20,P0.05)水平。 7.血清中炎癥因子濃度：LPS刺激后血清中TNF-α和IL-10的變化趨勢與其在支氣管肺泡灌洗液中變化趨勢相似。TNF-α和IL-10在6h的基礎(chǔ)水平分別是228.90±54.72pg/ml,236.55±45.92pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達(dá)到最高峰,分別為3619.76±376.30pg/ml和3261.16±484.70pg/ml。Imipramine干預(yù)也在6h和12h顯著降低了TNF-α(6h：1871.00±435.70VS3619.76±376.30,12h：1250.00±329.40VS2832.00±201.10, P0.05)和IL-10 (6h：1755.00±281.50VS3261.16±484.70,12h：1283.00±153.80VS2221.00±330.00,P0.05)水平。 8.肺組織炎癥因子mRNA表達(dá)：LPS刺激后肺組織中炎癥因子mRNA表達(dá)均顯著增加。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平在6h和12h顯著降低,IL-6 mRNA表達(dá)水平在18h顯著降低,IL-10mRNA表達(dá)水平在6h顯著降低。 9.NF-κBp65活性和含量：LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中小鼠肺組織NF-κBp65活性和含量均顯著增加,而imipramine干預(yù)可以在6h和12h顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65活性的增加,并在12h顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65含量的增加。。 10.肺組織凋亡指標(biāo)：imipramine干預(yù)可使Bcl-2蛋白表達(dá)量增加,Bax蛋白表達(dá)量減少,即imipramine干預(yù)可以減輕肺組織凋亡 11.imipramine干預(yù)可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的pp38、pASK1和Txnip蛋白表達(dá)的增加。 結(jié)論 1.在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷前30min給予小鼠imipramine干預(yù)可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存率。 2.Imipramine通過抑制NF-κB活性和量的增加抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。 3.Imipramine是通過抑制Txnip-ASK1-p38MAPK信號傳導(dǎo)途徑減輕急性肺損傷肺組織細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

一、腹腔注射LPs建立小鼠的急性肺損傷模型按照Kabir等【14，巧]學(xué)者報(bào)道的方法，經(jīng)腹腔注射LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷，建立LPS致急性肺損傷模型，其模型容易建立，肺損傷程度較穩(wěn)定，誘導(dǎo)過程中未出現(xiàn)動物死亡，安全性和可操作性優(yōu)于經(jīng)氣管穿刺注入，避免操作相關(guān)病原體感染的可能，且更符合臨床上急性肺損傷的病理生理改變。急性肺損傷小鼠表現(xiàn)為活動減少、反應(yīng)遲鈍、呼吸加速和毛發(fā)凌亂等特征。同時(shí)，肺組織病理也證實(shí)符合小鼠急性肺損傷的改變。二、生存分析統(tǒng)計(jì)每組小鼠的生存情況，觀察記錄每只小鼠的生存時(shí)間，繪制生存分析曲線，結(jié)果如圖1.1所示，動物死亡主要發(fā)生在24h一48h，其他時(shí)間則死亡較少。同時(shí)行Log一rank方法比較不同組之間生存率有無差異，結(jié)果表明imipramine可以明顯改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的生存率(57.14%Vsl4.29%，P<0.05)。

圖1.3小鼠急性肺損傷肺組織病理評分變化趨勢(n=6)。*P<0.05VSsham+vehiclegrouP;#P<0.05VS.LPS+imiPraminegrouP.表1.1肺組織損傷嚴(yán)重程度評分(n=6)組別Sham+imiPrmineSham+vehieleLPS+imiPramineLPS+vehiele0.85士0.250.9肚0.258.35士0.30*8.75士0.38*1.25士0.221.05士0.109.65士0.43*11.9士0.80*#0.55士0.150.35士0.1311.05士0.73*14.30士0.39*#~卜.nU卜n)l攤n”，

本文編號：2602829