【摘要】： 【課題研究的目的與意義】在急性肺損傷（ALI）以及其他多種肺部急性炎性疾病的致病機(jī)理中，LPS-TLR4信號通路被認(rèn)為起著核心作用，因此抑制這一信號通路對減輕ALI有著重要意義。目前發(fā)現(xiàn)的可抑制TLR4的分子中，單免疫球蛋白白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白(SIGIRR)是其中一員。其可通過與TLR4結(jié)合作用從而抑制LPS信號。由于既往研究未闡明SIGIRR是否表達(dá)于人肺泡上皮細(xì)胞，故本研究從檢測SIGIRR在人正常肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)開始，，探討SIGIRR在肺泡上皮細(xì)胞急性炎癥反應(yīng)中的作用�！痉椒ā坎捎妹庖呓M化、RT-PCR及Western blot的方法，從組織、蛋白及mRNA三個水平分別檢測了人正常肺組織以及肺泡II型上皮細(xì)胞來源的永生肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中SIGIRR的表達(dá)情況。選用LPS作為刺激因素，采用實(shí)時定量PCR及定量Western blot檢測A549細(xì)胞中SIGIRR mRNA及蛋白表達(dá)水平的動態(tài)變化。構(gòu)建含SIGIRR全長cDNA的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞使其過表達(dá)SIGIRR，采用雙螢光素酶報告系統(tǒng)研究SIGIRR對LPS導(dǎo)致的NF-kB激活的影響，經(jīng)過ELISA法研究SIGIRR在A549細(xì)胞中對LPS引起的細(xì)胞因子生成的影響，通過MTT檢測了SIGIRR過表達(dá)后LPS刺激下A549細(xì)胞的生長與存活情況�！窘Y(jié)果】經(jīng)免疫組化染色檢測，20例肺組織標(biāo)本中肺泡上皮細(xì)胞均有SIGIRR表達(dá)；經(jīng)RT-PCR檢測，20例肺組織標(biāo)本及A549細(xì)胞均在433bp處可見條帶；Western blot檢測到SIGIRR蛋白表達(dá)于正常肺組織及A549細(xì)胞，A549細(xì)胞中SIGIRR蛋白的分子量大小與正常肺組織中相同。通過實(shí)時定量PCR發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后3 h, 6 h及12h，SIGIRR mRNA水平較刺激前顯著降低；但是刺激后24h，SIGIRR mRNA又恢復(fù)至刺激前水平；通過定量Western blot分析發(fā)現(xiàn)刺激前與刺激后3h、6h、12h之間SIGIRR蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異，刺激后24h，蛋白表達(dá)顯著低于前幾個時間點(diǎn)。A549細(xì)胞過表達(dá)SIGIRR后，其NF-kB轉(zhuǎn)錄活性在LPS刺激后各時間均顯著低于對照組，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的水平亦顯著低于對照組，過表達(dá)SIGIRR的A549細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后各時間點(diǎn)生長抑制率顯著低于對照組�！窘Y(jié)論】SIGIRR表達(dá)于人正常肺泡上皮細(xì)胞，并參與了LPS誘發(fā)的肺泡上皮急性炎癥反應(yīng)并起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，有助于細(xì)胞的生長及存活。
【圖文】：

圖 1 T LR 4 信號 轉(zhuǎn) 導(dǎo)示 意 圖 （ 文 獻(xiàn) 3） M yD 8 8 于 19 9 0 年被 初次 命 名， 當(dāng)時 是作 為 M 1D +骨髓 來 源前 體 應(yīng)對 IL - 6 時進(jìn) 行 最 終 分 化 而 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 的 蛋 白 被 認(rèn) 識 的 。 “M yD ” 意即 “ 骨髓 分 化 ” ， 88 代表 其 在 所 有 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 的 基 因 中 的 序 列 號 [ 30 ] 。至 19 9 7 年， M yD 8 8 的功 能 開始 被 逐步 發(fā) 現(xiàn)。 通過 對 M yD 8 8 缺失 的小 鼠 的研 究 [ 31 ,3 2 ]得 知 ，M yD 8 8 參與 了 1 型白 介 1 受體 （ I L -1 R 1） [ 33 -3 6 ]的信 號轉(zhuǎn) 導(dǎo) ，隨 后 又 發(fā)現(xiàn) 其 在多 種 TL R s的 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 中 均 有 參 與 [ 3 7，3 8 ]。 M yD 8 8 缺 失 的 小 鼠 顯 示 出 對 TL R 2 , TL R 4, TL R 5, TL R 7 以及 TL R 9 的 配體 不 應(yīng)答 。 M yD 8 8 在 內(nèi)毒 素 引起 的 呼吸 道 炎癥 中 起著 關(guān) 鍵作 用 [ 39 ]。M yD 8 8 處于 多 種 TL R 依 賴 或 非 依 賴 的 信 號 通 路 的 “ 交叉 路 口 ”[ 40 ]。在 M yD 8 8 敲除 的 小鼠 中， 急性 期 支氣 管 收 縮， T N F 、I L -1 2 以 及 KC 的生 成 ，蛋 白 滲 漏 和中 性 粒 細(xì)胞 聚集 等 肺部 急 性 炎癥 反 應(yīng)均 完全 消 除 [ 39 ]。 M yD 8 8 不僅 參 與 TL R 信號 的

- 43 3b p4 33 bp -圖 2- 1 . 經(jīng)免 疫 組織 化學(xué) 染 色檢 測， S IG IR R 在所 有 檢測 的 20 例肺 組織 標(biāo) 本中 均 有 表 達(dá)。 L in e I, S IG IR R 在正 常 肺泡 上 皮細(xì) 胞 的表 達(dá) ; li n e II , 空 白對 照 （標(biāo) 本 未經(jīng) 一 抗 結(jié) 合， 替 換 為 等量 的 PB S） 。 20 0 倍放 大 。 3. 2 反轉(zhuǎn) 錄PC R檢測 正常 肺組 織 及A5 4 9 細(xì)胞 中SI GI RR mR NA 的表 達(dá)經(jīng) RT - P C R 檢測 ，所 有 20 例肺 組 織 標(biāo)本 均 在 4 33 b p 處可 見 條帶 （ 圖 2- 2A ） ， A5 4 9 細(xì) 胞及 正 常 肺 組織 表 達(dá) 條帶 均 處 于 43 3 b p 處（ 圖 2 -2 B ）A5 00 bp -2 50 bp -- 50 0b p- 25 0b p
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 修清玉;錢建美;王桂芳;黃海;方正;;不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌和表達(dá)前炎癥細(xì)胞因子及機(jī)制研究[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2008年03期

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1 吳原;難治性癲癇患者腦組織中生長錐相關(guān)蛋白初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

本文編號：2600283