【摘要】： 支氣管哮喘是呼吸系疾病中常見病和多發(fā)病之一。近20年來,全世界支氣管哮喘的患病率和死亡率均呈逐漸上升趨勢,這已經(jīng)引起全球的廣泛重視。 既往支氣管哮喘的研究過多地關(guān)注哮喘炎癥反應(yīng)的控制,然而對氣道重塑及氣道平滑肌的作用研究相對很少。由于哮喘的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜,所以炎癥的控制也異常困難,這方面的研究已經(jīng)多年沒有突破性進(jìn)展。所以很多學(xué)者開始不斷地調(diào)整哮喘研究主攻方向,尋找新的研究領(lǐng)域,哮喘氣道重塑正是在這樣的背景下開始引起學(xué)者的廣泛關(guān)注,并逐漸成為支氣管哮喘研究的熱點(diǎn)之一。 氣道重塑作為慢性哮喘的核心病理改變,是影響慢性哮喘患者生活質(zhì)量和勞動能力的最重要因素,它主要導(dǎo)致氣流阻塞的可逆性減小,呼氣期為主的通氣功能障礙加重,肺內(nèi)殘氣量增加,進(jìn)而導(dǎo)致不同程度的阻塞性肺氣腫,甚至肺源性心臟病。如果能有效地控制氣道重塑就可以最大限度地保護(hù)患者的肺功能,但是由于長期以來對其重視不足,導(dǎo)致具體體制至今不明,而且始終缺乏有效的治療手段,所以控制氣道重塑已經(jīng)成為哮喘預(yù)防和治療的當(dāng)務(wù)之急。 慢性哮喘氣道重塑是全氣道復(fù)雜改變的復(fù)合體,包括哮喘患者氣道不同于正常氣道的全部組織學(xué)改變,主要有氣道平滑肌增生及肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、上皮下纖維化、管腔狹窄、黏膜肥厚、氣管壁增厚、炎癥細(xì)胞浸潤等。氣道平滑肌是氣道重塑過程中核心的病理改變,氣道重塑的主要變化都是圍繞著氣道平滑肌細(xì)胞展開的。學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識到哮喘的治療離不開氣道平滑肌的治療,所以針對氣道平滑肌的治療也已經(jīng)成為哮喘治療的重要突破口。 平滑肌祖細(xì)胞是近年來血管重構(gòu)領(lǐng)域研究的重大發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)的觀念曾認(rèn)為在血管損傷部位的平滑肌細(xì)胞,是由受損部位的中膜遷移到新生內(nèi)膜的。但是現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為血管損傷部位的平滑肌細(xì)胞更有可能或至少有相當(dāng)一部分來源于其外周血中的前體細(xì)胞--平滑肌祖細(xì)胞(SPCs)。目前平滑肌祖細(xì)胞的研究工作還是處于起步階段�，F(xiàn)有研究認(rèn)為SPCs作為平滑肌細(xì)胞的前體細(xì)胞可能是一種或者一大類細(xì)胞;最有可能的來源就是骨髓中的多功能干細(xì)胞;現(xiàn)今仍未能找到SPC區(qū)別于其他細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記;因?yàn)镾PCs同時(shí)具有平滑肌細(xì)胞和干細(xì)胞部分特征,所以目前研究SPC所使用的細(xì)胞標(biāo)記大多都是干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物。 平滑肌祖細(xì)胞與慢性哮喘氣道重塑之間的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,但是平滑肌祖細(xì)胞在血管重構(gòu)中所發(fā)揮的作用已經(jīng)給我們一個(gè)全新的啟示。因?yàn)樵诩韧芯恐泻芏鄬W(xué)者都發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌細(xì)胞存在獨(dú)特的遷移、肥大和增殖等現(xiàn)象,但對其具體機(jī)制不甚清楚;再有在哮喘相關(guān)研究中還發(fā)現(xiàn)①哮喘動物外周血和肺組織中的CD34+細(xì)胞出現(xiàn)增加;②PDGF-BB參與哮喘氣道重塑的相關(guān)機(jī)制的調(diào)控,但是學(xué)者并沒有對這兩個(gè)現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制及意義給出非常令人信服的答案。然而PDGF-BB和CD34+均與平滑肌祖細(xì)胞密切相關(guān),前者與平滑肌祖細(xì)胞的分化誘導(dǎo)相關(guān),后者是平滑肌祖細(xì)胞的重要特征標(biāo)志之一。將上述信息整合后,我們就自然聯(lián)想到平滑肌祖細(xì)胞存在參與哮喘致病過程中的可能性,即平滑肌祖細(xì)胞在特定哮喘炎性因子的作用下出現(xiàn)趨化、定植和分化,并參與了慢性哮喘的氣道重塑。 為求證上面的假說我們設(shè)計(jì)了本研究課題,首先通過對比檢測哮喘大鼠與正常大鼠在外周血單個(gè)核細(xì)胞中平滑肌祖細(xì)胞含量上的差別,初步分析平滑肌祖細(xì)胞含量變化與哮喘狀態(tài)的是否有潛在聯(lián)系;再利用性別差異Y染色體的特征基因—SRY(sex-determining region on the Y chromosome)作為外源平滑肌祖細(xì)胞示蹤標(biāo)記物,通過原位雜交檢測SRY基因表達(dá)的方法觀察雄性大鼠來源SPCs在雌性哮喘大鼠氣道平滑肌層內(nèi)定植和分化情況,判斷SPCs是否參與了哮喘氣道重塑;最后再通過使用可能影響SPCs作用的藥物西司莫羅,觀察藥物作用后SPCs在哮喘氣道重塑中作用的變化。力求闡明慢性哮喘大鼠外周血中的平滑肌祖細(xì)胞可以參與慢性哮喘的氣道重塑;來源于SPCs的平滑肌細(xì)胞在氣道重塑中占有重要比例;抑制平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖可以明顯改善哮喘的氣道重塑,為今后慢性哮喘氣道重塑的預(yù)防和治療開拓了新的領(lǐng)域。 第一部分OVA霧化吸入對哮喘大鼠的外周血中平滑肌祖細(xì)胞含量的影響 目的:研究OVA霧化吸入對哮喘大鼠的外周血中平滑肌祖細(xì)胞含量的影響 方法:OVA致敏、霧化激發(fā)制作哮喘大鼠模型,常規(guī)觀察、HE染色和肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)鑒定評價(jià)模型哮喘模型;取正常大鼠和哮喘大鼠的外周血,Ficoll法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測其中SM-MHC和CD34陽性的表達(dá)情況,以此了解外周血單個(gè)核細(xì)胞中平滑肌祖細(xì)胞含量。 結(jié)果:哮喘組大鼠支氣管肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞數(shù)量分別為(1.34±0.06)×10~6、(0.54±0.07)×10~6、(3.20±0.79)×10~6和(5.85±0.86)×10~6膚,均明顯高于正常對照組大鼠肺泡灌洗液相應(yīng)細(xì)胞含量(0.96±0.11)×10~6、(0.04±0.02)×10~6、(0.43±0.16)×10~6和(0.21±0.11)×10~6;哮喘組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+為1.10±0.17%,MHC+為12.02±1.80%,CD34/MHC均陽性的比例為0.95±0.09%,亦明顯高于對照組的比例:0.22±0.07%、1.65±0.11%和0.21±0.05%(P 0.05)。 結(jié)論:哮喘組大鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞中平滑肌祖細(xì)胞含量要高于正常對照組大鼠。在哮喘狀態(tài)下平滑肌祖細(xì)胞可能受到特定炎性因子刺激后,數(shù)量上升并參與到哮喘的致病過程中。 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定和平滑肌祖細(xì)胞鑒定 目的:分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為平滑肌祖細(xì)胞 方法:取正常雄性Wistar大鼠四肢長骨,無菌狀態(tài)用無血清培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,取骨髓細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶內(nèi),使用全貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)傳代鑒定;觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),流式儀檢測其細(xì)胞表型特點(diǎn);觀察其在體外條件下分化為成骨和脂肪細(xì)胞的能力。再取P4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用含PDGF-BB的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)2周,檢測其中α-SMA和CD34陽性的表達(dá)情況,了解其分化為平滑肌祖細(xì)胞情況。 結(jié)果:全骨髓貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種確實(shí)可行的辦法,培養(yǎng)獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞符合MSC的典型特點(diǎn)。在體外條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨和脂肪細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含PDGF-BB的培養(yǎng)液作用下,細(xì)胞性質(zhì)發(fā)生明顯地改變,可以同時(shí)具有干細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn),CD34陽性上升至32%,α-SMA表達(dá)陽性率為62%。 結(jié)論:體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在被誘導(dǎo)分化為平滑肌祖細(xì)胞,可以作為研究平滑肌祖細(xì)胞的重要工具。 第三部分平滑肌祖細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用 目的:觀察平滑肌祖細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用 方法:采用正常雌性Wistar大鼠復(fù)制慢性哮喘氣道模型,在哮喘模型霧化激發(fā)的第4周開始將雄性來源的平滑肌祖細(xì)胞(10~6個(gè))經(jīng)鼠尾靜脈注射入,每周1次,連續(xù)4周。第12周分別取動物的氣道組織標(biāo)本制作切片,并同時(shí)分離氣管進(jìn)行氣道平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),通過原位雜交檢測SRY陽性細(xì)胞氣道組織標(biāo)本制作切片中表達(dá)情況;再通過原位雜交檢測SRY陽性細(xì)胞在純化后的氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)情況;觀察平滑肌祖細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中的定位和分化情況。 結(jié)果:雌性哮喘大鼠在尾靜脈注射雄性來源的SPCs后平滑氣道平滑肌層出現(xiàn)表達(dá)SRY陽性的平滑肌細(xì)胞,而雌性正常對照組動物的氣道中未見SRY陽性平滑肌細(xì)胞定植;在分離培養(yǎng)的同組動物氣道平滑肌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)SRY陽性的平滑肌細(xì)胞。結(jié)論:平滑肌祖細(xì)胞在慢性哮喘病程中可以定植到氣道并分化為氣道平滑肌參與哮喘的氣道重塑。 第四部分西羅莫司對哮喘氣道重塑中平滑肌祖細(xì)胞作用的影響 目的:觀察西羅莫司對哮喘氣道重塑中平滑肌祖細(xì)胞作用的影響 方法:將SPC分別放在DM、0.1ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml不同藥物濃度的培養(yǎng)基中作用48小時(shí)后,通過觀察MTT吸光度值和計(jì)數(shù)變化,了解西羅莫司對平滑肌祖細(xì)胞增殖的影響。在含PDGF-BB的培養(yǎng)液中加入不同濃度的西羅莫司(對照組、0.1ng/ml和1 ng/ml),分別對MSC作用10天后,觀察α-SMA陽性表達(dá)情況,了解西羅莫司對平滑肌祖細(xì)胞分化的影響。取正常雌性Wistar大鼠復(fù)制慢性哮喘氣道模型,在模型制作的過程中將完成誘導(dǎo)的雄性來源的平滑肌祖細(xì)胞經(jīng)鼠尾靜脈注射入,在模型制作的后4周每天霧化激發(fā)后予以西羅莫司霧化吸入治療,于12周分別取動物的氣道組織標(biāo)本制作切片,通過原位雜交檢測SRY陽性細(xì)胞表達(dá)情況,觀察西羅莫司霧化吸入治療對平滑肌祖細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中作用的影響。 結(jié)果:西羅莫司不同藥物濃度組在作用48小時(shí)后,細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法檢測吸光度值也明顯低于對照組,DM、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml各藥物濃度組中作用48小時(shí)后,各藥物濃度組細(xì)胞的吸光度值分別為0.75±0.06、0.44±0.04、0.33±0.02、0.20±0.01和0.18±0.01(P 0.05)。西羅莫司不同藥物濃度組(對照組、0.1ng/ml和1ng/ml)在作用10天后,細(xì)胞的α-SMA陽性表達(dá)率分別為71%、24%和4%(P 0.05)。OVA哮喘組和西羅莫司哮喘治療組的氣道平滑肌層中均出現(xiàn)SRY陽性表達(dá)的細(xì)胞,但西羅莫司治療哮喘組大鼠氣道組織中SRY陽性細(xì)胞數(shù)量要明顯少于OVA哮喘組,PBS霧化對照組大鼠氣道內(nèi)未見SRY陽性細(xì)胞表達(dá)。 結(jié)論:西羅莫司可以顯著抑制平滑肌祖細(xì)胞的分化和增殖,其抑制作用與藥物濃度及作用時(shí)間存在相關(guān)性;西羅莫司霧化吸入可以通過抑制平滑肌祖細(xì)胞的作用,改善慢性哮喘的氣道重塑,為哮喘氣道重塑的治療開辟新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)博士研究生學(xué)位論文結(jié) 果一、哮喘模型動物一般情況觀察哮喘組大鼠經(jīng)過OVA霧化吸入激發(fā)后，初起煩躁不安，易激惹，，跑動不停，跳躍；隨后出現(xiàn)張口喘息，腹部翕動，并且頻繁出現(xiàn)噴嚏癥狀；后期常出現(xiàn)積聚，精神不振，嚴(yán)重者伴有大汗癥狀。對照組大鼠行為敏捷，未見異常。

第二軍醫(yī)大學(xué)博士研究生學(xué)位論文結(jié) 果一、哮喘模型動物一般情況觀察哮喘組大鼠經(jīng)過OVA霧化吸入激發(fā)后，初起煩躁不安，易激惹，跑動不停，跳躍；隨后出現(xiàn)張口喘息，腹部翕動，并且頻繁出現(xiàn)噴嚏癥狀；后期常出現(xiàn)積聚，精神不振，嚴(yán)重者伴有大汗癥狀。對照組大鼠行為敏捷，未見異常。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R562.25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何安南;;支氣管哮喘氣道重塑的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2008年18期

2 龍學(xué)明;唐耀平;黃潔;;支氣管哮喘氣道重塑的研究進(jìn)展[J];廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年01期

3 卞宏;朱述陽;劉平莉;;鹽酸戊乙奎醚對哮喘鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖作用的研究[J];臨床合理用藥雜志;2009年01期

4 吳斌;戴元榮;;P27~(KiP-1)蛋白對支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌增生的影響[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2008年01期

5 張占鋒;霍博雅;;支氣管哮喘氣道重塑的中醫(yī)藥治療現(xiàn)狀[J];中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志;2010年11期

6 楊妍;黃茂;;支氣管哮喘氣道重塑機(jī)制研究進(jìn)展[J];中華哮喘雜志(電子版);2009年01期

7 趙麗敏;馬利軍;張羅獻(xiàn);吳紀(jì)珍;;參麥注射液對人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J];中國臨床醫(yī)學(xué);2009年06期

8 吳斌;王秀芬;戴元榮;葉永青;閆剛;;P27~(kip-1)蛋白對支氣管哮喘大鼠模型氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2009年10期

9 鞏雪芳;薄建萍;;生長因子與氣道重塑——生長因子在支氣管哮喘氣道重塑過程中作用的新進(jìn)展[J];中華哮喘雜志(電子版);2010年05期

10 葛海燕;黃茂;姚欣;殷凱生;;白三烯受體拮抗劑對哮喘小鼠氣道重塑及細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 黎希;辛建保;;孟魯司特聯(lián)合吸入布地奈德對支氣管哮喘大鼠氣道重塑及體內(nèi)IL-33表達(dá)的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

2 王志強(qiáng);李敏;;青蒿琥酯對支氣管哮喘大鼠氣道組織學(xué)變化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第三次大會論文匯編[C];2010年

3 管小俊;李昌崇;蘇苗賞;鄭仰明;;ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在支氣管哮喘大鼠氣道重塑中作用初步探討[A];2006（第三屆）江浙滬兒科學(xué)術(shù)會議暨浙江省兒科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

4 孫磊明;戴元榮;;PKB/Bad在哮喘氣道重塑中的作用[A];2009年浙江省危重病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

5 吳壯;羅永峰;徐軍;;利用SMA-Cre/R26R轉(zhuǎn)基因報(bào)告鼠建立支氣管哮喘氣道重塑動物模型[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

6 王紹斌;沈華浩;;支氣管哮喘小鼠氣道重塑過程的動態(tài)觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

7 張曉巖;林江濤;李香凝;楊萌;俞紅霞;李桂琴;黃小杰;王萍;張嵐;周童亮;舒峻;;纖溶酶原激活物抑制劑1基因多態(tài)性與支氣管哮喘氣道重塑關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

8 沈華浩;王紹斌;;布地奈德能抑制但僅能部分逆轉(zhuǎn)支氣管哮喘小鼠氣道重塑的發(fā)生[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

9 張e

本文編號：2595487