發(fā)布時(shí)間：2020-03-12 04:18

【摘要】：目的 1.建立卵清蛋白致敏/激發(fā)肺部變應(yīng)性炎癥小鼠模型,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 2.探討卵清蛋白致敏/激發(fā)哮喘小鼠肺臟病理及肺泡灌洗液(BALF)的細(xì)胞形態(tài) 和分子生物學(xué)改變,初步分析哮喘變應(yīng)性炎癥的發(fā)病機(jī)制。 方法 20只4-6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組,每組10只,實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用卵清蛋白于第0、14天致敏,第24-26天激發(fā)小鼠,對(duì)照組用生理鹽水。末次激發(fā)結(jié)束后48小時(shí)處死小鼠,留取血清、肺臟病理、肺泡灌洗液、肺臟冰凍組織等標(biāo)本,比較兩組肺臟病理變化,及肺泡灌洗液內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。 結(jié)果 1.致敏/激發(fā)組小鼠肺臟病理組織學(xué)改變符合變應(yīng)性炎癥表現(xiàn)。 2.與正常對(duì)照組小鼠相比,致敏/激發(fā)組小鼠的BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著增多,細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果表明嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例明顯增多。 3.致敏/激發(fā)組小鼠BALF和血漿中IL-4水平明顯升高,而IFN-Y水平顯著下降。 結(jié)論 1.采用卵清蛋白致敏/激發(fā)小鼠,成功建立了小鼠哮喘模型。 2.通過對(duì)血清及肺泡灌洗液中各種細(xì)胞因子的測(cè)定,證實(shí)哮喘免疫紊亂類型是Thl/Th2比例失衡,Th2細(xì)胞增多及其分泌的各種細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。 目的 1.分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料。 2.觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變化,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物,初步了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。 方法 無(wú)菌狀態(tài)下完整分離小鼠下肢股骨和脛骨,提取骨髓腔內(nèi)細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液裂解無(wú)核的紅細(xì)胞,將骨髓有核細(xì)胞至于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過反復(fù)換液去除懸浮細(xì)胞,通過多次傳代可以除去貼壁的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,達(dá)到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純化。取P2代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD34、CD44的表達(dá)。 結(jié)果 1.顯微鏡下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),多為長(zhǎng)梭形,在細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛期,形態(tài)均一,生長(zhǎng)速度快,呈典型的旋渦狀克隆樣生長(zhǎng)。 2.細(xì)胞儀分析結(jié)果表明P2代細(xì)胞中CD29(+)、CD44(+)、CD34(-)細(xì)胞純度95%。 結(jié)論 通過反復(fù)試驗(yàn),我們成功分離和純化了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過反復(fù)傳代擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來(lái)源。 目的 研究腹腔注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可以減輕哮喘小鼠肺部的炎癥反應(yīng),發(fā)揮治療效果,初步探索其可能的作用機(jī)制。 方法 實(shí)驗(yàn)分為五組： 1.對(duì)照組；生理鹽水腹腔注射及霧化吸入。 2.哮喘對(duì)照組；OVA致敏/激發(fā)(方法同第一部分)。 3.哮喘+BMSCs治療組；每次激發(fā)前2小時(shí)腹腔注射2ml含1×107個(gè)BMSCs的培養(yǎng)液。 4.哮喘+BMSCs培養(yǎng)液治療組；每次激發(fā)前2小時(shí)腹腔注射2mlBMSCs的培養(yǎng)液。 5.哮喘+BMSCs裂解液治療組；每次激發(fā)前2小時(shí)腹腔注射含2ml含1×107個(gè)BMSCs的細(xì)胞裂解液。 連續(xù)激發(fā)三次,木次激發(fā)后48小時(shí)處死小鼠,收集肺臟病理、肺泡灌洗液、肺冰凍組織等進(jìn)行分析。 結(jié)果 1.與正常對(duì)照組相比,哮喘對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的變應(yīng)性炎癥表現(xiàn)。 2.與哮喘對(duì)照組相比,BMSCs治療組顯示出明顯的治療作用：肺部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)明顯減輕,肺泡及血清中的炎癥因子明顯下降。 3.與哮喘對(duì)照組相比,BMSCs培養(yǎng)液治療組及BMSCs裂解液治療組也顯示出一定的治療作用。 4.與BMSCs治療組相比,BMSCs培養(yǎng)液治療組及MSC裂解液治療組治療作用相對(duì)較弱。 5. BMSCs培養(yǎng)液治療組及BMSCs裂解液治療組治療作用基本相似。 6.實(shí)驗(yàn)中未觀察到明顯BMSCs治療的不良反應(yīng)。 結(jié)論 1.注射BMSCs對(duì)急性哮喘炎癥有治療作用,且無(wú)明顯不良反應(yīng)。 2. BMSCs培養(yǎng)液及BMSCs裂解液對(duì)急性哮喘也有治療作用,但是該作用與直接注射BMSCs的治療作用相比較弱。 目的 通過觀察與BMSCs共培養(yǎng)后的T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài),進(jìn)一步闡述BMSCs治療哮喘的作用機(jī)制。 方法 分離脾臟T淋巴細(xì)胞,BMSCs與T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng),共培養(yǎng)72小時(shí)后收集懸浮T細(xì)胞及培養(yǎng)液,離心后,上清液測(cè)IL-4、IL-17、IFN-γ水平。沉淀后的T細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白,應(yīng)用Western blot測(cè)定蛋白中Lck含量。實(shí)驗(yàn)共分為六組： 1.哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)； 2.正常小鼠T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)； 3.正常小鼠T淋巴細(xì)胞與正常小鼠BMSC在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)； 4.哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞與哮喘小鼠BMSC在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)； 5.哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞與正常小鼠BMSC在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)； 6.哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞與正常小鼠BMSC在哮喘小鼠肺組織勻漿中共培養(yǎng)。 結(jié)果 1.各組培養(yǎng)液中IL-4、IL-17、IFN-γ水平無(wú)明顯差異。 2.第一組哮喘小鼠和第四組與哮喘小鼠BMSCs共培養(yǎng)的哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞Lck蛋白的表達(dá)增多,其他組T淋巴細(xì)胞Lck蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別。 結(jié)論 1. BMSCs通過抑制T淋巴細(xì)胞內(nèi)Lck蛋白的表達(dá)抑制其活化,阻斷其功能。 2.哮喘小鼠BMSCs功能受損,不能發(fā)揮免疫抑制功能。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R562.25

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2586450