【摘要】：背景：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由于感染、休克和創(chuàng)傷等多種原因引起的肺部并發(fā)癥,可進一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDs)。臨床上以嚴重低氧血癥、彌漫性肺部浸潤和肺順應(yīng)性下降為特征,其發(fā)病機制迄今尚未完全闡明,臨床治療手段也非常有限。Gab1作為支架蛋白與多種酪氨酸磷酸酶受體相偶聯(lián),在分子信號通路傳導過程中起重要作用。在急性肺損傷中很多基因發(fā)現(xiàn)與上皮細胞損傷/凋亡相關(guān)聯(lián),但支架蛋白Gab1在調(diào)控肺泡或者上皮細胞穩(wěn)態(tài)過程中研究依然未知。 目的：利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立肺泡ⅡI型上皮細胞特異性Gab1基因敲除小鼠并進行初步表型分析,并在急性肺損傷過程中研究Gab1在維持肺泡表面活性穩(wěn)態(tài)中的作用。 實驗方法：本研究選擇了肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性表達反式激活元件的轉(zhuǎn)基因小鼠(SPCrtTA)作為介導敲除的工具鼠,將其與表達(TetoCre)重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠交配獲得了SPCrtTA-TetoCre雙轉(zhuǎn)基因小鼠,接著用SPCrtTA-TetoCre雙轉(zhuǎn)基因小鼠與Gab1條件基因打靶小鼠交配獲得了可誘導型肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性Gab1基因敲除小鼠,三重轉(zhuǎn)基因小鼠在強力霉素的誘導下使得Gab1在肺泡Ⅱ型上皮細胞中發(fā)生特異性缺失,肺泡Ⅱ型上皮細胞Gab1基因敲除小鼠無胚胎致死,能夠順利出生。Gab1在肺泡上皮細胞的表達通過mRNA水平和蛋白水平進行評估,LPS通過氣道給藥的方式對肺泡造成強烈的損傷,急性肺損傷的程度則通過組化以及酶聯(lián)免疫吸附等試驗進行檢測。實驗結(jié)果檢測方式： (1)強力霉素給藥7天,誘導小鼠Gab1在肺泡Ⅱ型上皮細胞中缺失后以體積描記法確定小鼠肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn). (2)小鼠進行右側(cè)支氣管肺泡灌洗,灌洗液(BALF)收集1hr內(nèi)取0.2ml,用白細胞計數(shù)液倍比稀釋后進行白細胞計數(shù)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測BALF中的IL-1,IL-6, TNF-alfa等炎癥因子水平。 (3)取未灌洗的肺組織,經(jīng)過10%甲醛溶液中固定,漂洗、脫水、透明和石蠟包埋。切片常規(guī)化蠟、梯度酒精下入水,進行HE染色。 (4)提取小鼠肺組織蛋白,用免疫印跡電泳方法觀測肺表面活性蛋白(SPA,SPB,SPC,SPD)表達情況。 (5)小鼠氣道內(nèi)滴注LPS24hr后,檢測BALF中白細胞總數(shù),肺組織病理以及肺泡表面活性蛋白表達。 (6)采取兩組間均數(shù)t檢驗,P0.05為有顯著性差異,P0.01為有非常顯著性差異。實驗結(jié)果：肺組織切片后HE染色結(jié)果顯示Gab1敲除小鼠肺組織形態(tài)基本正常,模型組符合ALI改變；Gab1敲除小鼠肺動態(tài)順應(yīng)性降低,肺泡表面活性蛋白表達降低,且并未引起炎癥反應(yīng)。LPS刺激,Gab1敲除小鼠引起一個更為嚴重的炎癥反應(yīng),白細胞計數(shù)表明炎癥細胞明顯增多,BALF中炎癥因子表達上升,Realtime-PCR結(jié)果表明肺泡Ⅱ型上皮細胞中肺泡表面活性蛋白表達顯著降低。 結(jié)論 1,本研究成功建立了肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性Gab1基因敲除小鼠 2,小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞Gab1的缺失降低了肺泡表面活性蛋白的表達同時也影響了小鼠正常的肺功能 3,在LPS誘導的急性肺損傷反應(yīng)過程中,肺泡Ⅱ型上皮細胞Gab1的缺失誘發(fā)更為嚴重的炎癥反應(yīng)
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R563.8

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