【摘要】：背景：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由于感染、休克和創(chuàng)傷等多種原因引起的肺部并發(fā)癥,可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDs)。臨床上以嚴(yán)重低氧血癥、彌漫性肺部浸潤(rùn)和肺順應(yīng)性下降為特征,其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明,臨床治療手段也非常有限。Gab1作為支架蛋白與多種酪氨酸磷酸酶受體相偶聯(lián),在分子信號(hào)通路傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。在急性肺損傷中很多基因發(fā)現(xiàn)與上皮細(xì)胞損傷/凋亡相關(guān)聯(lián),但支架蛋白Gab1在調(diào)控肺泡或者上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過(guò)程中研究依然未知。 目的：利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立肺泡ⅡI型上皮細(xì)胞特異性Gab1基因敲除小鼠并進(jìn)行初步表型分析,并在急性肺損傷過(guò)程中研究Gab1在維持肺泡表面活性穩(wěn)態(tài)中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法：本研究選擇了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性表達(dá)反式激活元件的轉(zhuǎn)基因小鼠(SPCrtTA)作為介導(dǎo)敲除的工具鼠,將其與表達(dá)(TetoCre)重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠交配獲得了SPCrtTA-TetoCre雙轉(zhuǎn)基因小鼠,接著用SPCrtTA-TetoCre雙轉(zhuǎn)基因小鼠與Gab1條件基因打靶小鼠交配獲得了可誘導(dǎo)型肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性Gab1基因敲除小鼠,三重轉(zhuǎn)基因小鼠在強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)下使得Gab1在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中發(fā)生特異性缺失,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Gab1基因敲除小鼠無(wú)胚胎致死,能夠順利出生。Gab1在肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)通過(guò)mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行評(píng)估,LPS通過(guò)氣道給藥的方式對(duì)肺泡造成強(qiáng)烈的損傷,急性肺損傷的程度則通過(guò)組化以及酶聯(lián)免疫吸附等試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)方式： (1)強(qiáng)力霉素給藥7天,誘導(dǎo)小鼠Gab1在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中缺失后以體積描記法確定小鼠肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdyn). (2)小鼠進(jìn)行右側(cè)支氣管肺泡灌洗,灌洗液(BALF)收集1hr內(nèi)取0.2ml,用白細(xì)胞計(jì)數(shù)液倍比稀釋后進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)BALF中的IL-1,IL-6, TNF-alfa等炎癥因子水平。 (3)取未灌洗的肺組織,經(jīng)過(guò)10%甲醛溶液中固定,漂洗、脫水、透明和石蠟包埋。切片常規(guī)化蠟、梯度酒精下入水,進(jìn)行HE染色。 (4)提取小鼠肺組織蛋白,用免疫印跡電泳方法觀測(cè)肺表面活性蛋白(SPA,SPB,SPC,SPD)表達(dá)情況。 (5)小鼠氣道內(nèi)滴注LPS24hr后,檢測(cè)BALF中白細(xì)胞總數(shù),肺組織病理以及肺泡表面活性蛋白表達(dá)。 (6)采取兩組間均數(shù)t檢驗(yàn),P0.05為有顯著性差異,P0.01為有非常顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肺組織切片后HE染色結(jié)果顯示Gab1敲除小鼠肺組織形態(tài)基本正常,模型組符合ALI改變；Gab1敲除小鼠肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性降低,肺泡表面活性蛋白表達(dá)降低,且并未引起炎癥反應(yīng)。LPS刺激,Gab1敲除小鼠引起一個(gè)更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),白細(xì)胞計(jì)數(shù)表明炎癥細(xì)胞明顯增多,BALF中炎癥因子表達(dá)上升,Realtime-PCR結(jié)果表明肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中肺泡表面活性蛋白表達(dá)顯著降低。 結(jié)論 1,本研究成功建立了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞特異性Gab1基因敲除小鼠 2,小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Gab1的缺失降低了肺泡表面活性蛋白的表達(dá)同時(shí)也影響了小鼠正常的肺功能 3,在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷反應(yīng)過(guò)程中,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Gab1的缺失誘發(fā)更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.8

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