【摘要】：背景 特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）的發(fā)生與成纖維細胞（Fibroblast,Fb）轉(zhuǎn)換為肌成纖維細胞（Myofibroblast, MFb）密切相關[1]。有關MFb的形成及來源除與肺間質(zhì)中自身的Fb轉(zhuǎn)分化有關外，骨髓干細胞、肺泡上皮細胞以及微血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells, ECs）亦可能是MFb的來源之一[2]，但是相關研究已經(jīng)公認結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factoe,TGF-β）是導致MFb表型形成的關鍵細胞因子[3]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化大鼠血清中的CTGF、TGF-β1持續(xù)高表達，而肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascularendothelial cells, PMVECs）可能是上述致肺纖維化細胞因子的主要來源之一[4,5]。 研究證實，內(nèi)皮細胞（endothelial cell,EC）的增殖和分化是細胞因子相關信號途徑調(diào)控的結果，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等， VEGF/Flk-1（VEGFR2）信號是調(diào)控ECs增殖的主要途徑[6,7]。細胞膜瞬時受體電位通道（Transient receptor potential channels，TRPCs）的激活可介導細胞鈣離子內(nèi)流增加，進而上調(diào)VEGF/Flk-1的活性引起內(nèi)皮細胞的增殖[8]。近年來發(fā)現(xiàn)TRPC1和TRPC3/6/7是參與VEGF引起的ECs增殖調(diào)控的重要離子通道[9,10]，且VEGF可引起內(nèi)皮細胞CTGF的表達增高[11]，但在BLM損傷的大鼠PMVECs異常高表達的CTGF是否與TRPC1和TRPC3/6/7通道表達異常有關未見報道。 方法和目的 本實驗通過氣管內(nèi)注入BLM制作SD大鼠肺纖維化模型，于7d、14d后取大鼠肺組織做VG染色，證實造模成功。于各時間點取BLM及對照組大鼠周邊肺組織做PMVECs的原代培養(yǎng)，經(jīng)光鏡、電鏡觀察以及免疫細胞熒光化學法鑒定證實PMVECs體外培養(yǎng)成功。應用免疫組織化學法以及免疫細胞熒光化學檢測PMVECs中CTGF、α-SMA、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表達情況；應用激光共聚焦顯微鏡體外觀察，TRPC通道阻滯劑2-APB及VEGF受體（Flk-1）阻滯劑SU1498作用各組PMVECs后，細胞內(nèi)鈣離子的變化趨勢；免疫熒光染色及蛋白印記（western blot，WB）法檢測各組PMVECs中TRPC1、TRPC3/6/7通道和FLK-1蛋白表達情況；且采用WB法檢測體外TRPC通道阻斷后PMVECs中α-SMA、PCNA和CTGF的表達情況。應用流式細胞儀以及PCNA的免疫熒光細胞化學染色測定PMVECs的生長狀態(tài)，深入探討TRPCs通道與BLM誘導的肺纖維化（pulmonary fibrosis,PF）大鼠PMVECs表型和功能改變間的關系，為PF的早期診斷和確定早期干預的細胞靶點提供實驗和理論基礎。 結果 1、光鏡觀察各組PMVECs形態(tài)呈典型內(nèi)皮細胞的鋪路石狀，電鏡檢測出95%原代培養(yǎng)細胞表達W-P小體，免疫熒光化學證實培養(yǎng)細胞VIII因子相關抗原表達陽性，證實PMVECs原代培養(yǎng)成功； 2、流式細胞儀周期檢測證實BLM7d組內(nèi)皮細胞增殖指數(shù)較正常對照組高,增殖指數(shù)為0.599，，且BLM14d組G2期細胞數(shù)的百分比也增高，提示BLM損傷后的PMVECs增殖能力提高； 3、免疫組織化學及免疫細胞熒光化學顯示BLM組PMVECs較對照組CTGF、α-SMA和PCNA表達均明顯增多； 4、激光共聚焦顯微鏡體外觀察顯示TRPCs通道阻滯后BLM組較對照組PMVECs[Ca2+]i明顯下降，阻滯FLK-1后[Ca2+]i亦呈明顯下降； 5、免疫熒光細胞化學及WB檢測顯示BLM7d、14d組PMVECs中TRPC1和TRPC3/6/7通道蛋白較對照組表達明顯增高,且BLM7d、14d組PMVECs中FLK-1較正常組表達也明顯增高； 6、WB檢測顯示體外阻斷PMVECs的TRPCs通道后BLM7d、14d組較對照組CTGF、α-SMA及PCNA蛋白表達均顯著下降。 結論 1、BLM誘導大鼠肺纖維化導致的PMVECs轉(zhuǎn)化為增殖表型并過度分泌CTGF是肺纖維化形成的另一重要原因； 2、TRPCs功能紊亂在BLM大鼠PMVECs增殖分化、細胞內(nèi)鈣超載及VEGF/Flk-1信號激活起著關鍵作用。體外實驗結果提示，BLM損傷所致的大鼠肺纖維化可能是TRPCs功能紊亂性疾病。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R563

【參考文獻】

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1 南海燕;崔光彬;顏林楓;殷茜;魏經(jīng)國;;肺纖維化大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞[Ca~(2+)]i變化及其機制探討[J];第四軍醫(yī)大學學報;2007年13期

2 顏林楓;南海燕;崔光彬;殷茜;魏經(jīng)國;;肺微血管內(nèi)皮細胞表型改變與博萊霉素所致大鼠肺纖維化的關系[J];第四軍醫(yī)大學學報;2008年16期

3 崔光彬;魏經(jīng)國;王瑋;殷茜;王春梅;魏龍曉;楊浩;;博萊霉素對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞緊密連接改變及Cx43表達變化的影響[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2006年02期

本文編號：2537655