【摘要】：背景 特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）的發(fā)生與成纖維細(xì)胞（Fibroblast,Fb）轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblast, MFb）密切相關(guān)[1]。有關(guān)MFb的形成及來(lái)源除與肺間質(zhì)中自身的Fb轉(zhuǎn)分化有關(guān)外，骨髓干細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells, ECs）亦可能是MFb的來(lái)源之一[2]，但是相關(guān)研究已經(jīng)公認(rèn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factoe,TGF-β）是導(dǎo)致MFb表型形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子[3]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠血清中的CTGF、TGF-β1持續(xù)高表達(dá)，而肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascularendothelial cells, PMVECs）可能是上述致肺纖維化細(xì)胞因子的主要來(lái)源之一[4,5]。 研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell,EC）的增殖和分化是細(xì)胞因子相關(guān)信號(hào)途徑調(diào)控的結(jié)果，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等， VEGF/Flk-1（VEGFR2）信號(hào)是調(diào)控ECs增殖的主要途徑[6,7]。細(xì)胞膜瞬時(shí)受體電位通道（Transient receptor potential channels，TRPCs）的激活可介導(dǎo)細(xì)胞鈣離子內(nèi)流增加，進(jìn)而上調(diào)VEGF/Flk-1的活性引起內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TRPC1和TRPC3/6/7是參與VEGF引起的ECs增殖調(diào)控的重要離子通道[9,10]，且VEGF可引起內(nèi)皮細(xì)胞CTGF的表達(dá)增高[11]，但在BLM損傷的大鼠PMVECs異常高表達(dá)的CTGF是否與TRPC1和TRPC3/6/7通道表達(dá)異常有關(guān)未見(jiàn)報(bào)道。 方法和目的 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管內(nèi)注入BLM制作SD大鼠肺纖維化模型，于7d、14d后取大鼠肺組織做VG染色，證實(shí)造模成功。于各時(shí)間點(diǎn)取BLM及對(duì)照組大鼠周邊肺組織做PMVECs的原代培養(yǎng)，經(jīng)光鏡、電鏡觀察以及免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法鑒定證實(shí)PMVECs體外培養(yǎng)成功。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法以及免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測(cè)PMVECs中CTGF、α-SMA、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表達(dá)情況；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡體外觀察，TRPC通道阻滯劑2-APB及VEGF受體（Flk-1）阻滯劑SU1498作用各組PMVECs后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化趨勢(shì)；免疫熒光染色及蛋白印記（western blot，WB）法檢測(cè)各組PMVECs中TRPC1、TRPC3/6/7通道和FLK-1蛋白表達(dá)情況；且采用WB法檢測(cè)體外TRPC通道阻斷后PMVECs中α-SMA、PCNA和CTGF的表達(dá)情況。應(yīng)用流式細(xì)胞儀以及PCNA的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定PMVECs的生長(zhǎng)狀態(tài)，深入探討TRPCs通道與BLM誘導(dǎo)的肺纖維化（pulmonary fibrosis,PF）大鼠PMVECs表型和功能改變間的關(guān)系，為PF的早期診斷和確定早期干預(yù)的細(xì)胞靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 結(jié)果 1、光鏡觀察各組PMVECs形態(tài)呈典型內(nèi)皮細(xì)胞的鋪路石狀，電鏡檢測(cè)出95%原代培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)W-P小體，免疫熒光化學(xué)證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞VIII因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性，證實(shí)PMVECs原代培養(yǎng)成功； 2、流式細(xì)胞儀周期檢測(cè)證實(shí)BLM7d組內(nèi)皮細(xì)胞增殖指數(shù)較正常對(duì)照組高,增殖指數(shù)為0.599，，且BLM14d組G2期細(xì)胞數(shù)的百分比也增高，提示BLM損傷后的PMVECs增殖能力提高； 3、免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞熒光化學(xué)顯示BLM組PMVECs較對(duì)照組CTGF、α-SMA和PCNA表達(dá)均明顯增多； 4、激光共聚焦顯微鏡體外觀察顯示TRPCs通道阻滯后BLM組較對(duì)照組PMVECs[Ca2+]i明顯下降，阻滯FLK-1后[Ca2+]i亦呈明顯下降； 5、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)及WB檢測(cè)顯示BLM7d、14d組PMVECs中TRPC1和TRPC3/6/7通道蛋白較對(duì)照組表達(dá)明顯增高,且BLM7d、14d組PMVECs中FLK-1較正常組表達(dá)也明顯增高； 6、WB檢測(cè)顯示體外阻斷PMVECs的TRPCs通道后BLM7d、14d組較對(duì)照組CTGF、α-SMA及PCNA蛋白表達(dá)均顯著下降。 結(jié)論 1、BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化導(dǎo)致的PMVECs轉(zhuǎn)化為增殖表型并過(guò)度分泌CTGF是肺纖維化形成的另一重要原因； 2、TRPCs功能紊亂在BLM大鼠PMVECs增殖分化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及VEGF/Flk-1信號(hào)激活起著關(guān)鍵作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BLM損傷所致的大鼠肺纖維化可能是TRPCs功能紊亂性疾病。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 南海燕;崔光彬;顏林楓;殷茜;魏經(jīng)國(guó);;肺纖維化大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞[Ca~(2+)]i變化及其機(jī)制探討[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年13期

2 顏林楓;南海燕;崔光彬;殷茜;魏經(jīng)國(guó);;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表型改變與博萊霉素所致大鼠肺纖維化的關(guān)系[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年16期

3 崔光彬;魏經(jīng)國(guó);王瑋;殷茜;王春梅;魏龍曉;楊浩;;博萊霉素對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接改變及Cx43表達(dá)變化的影響[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2006年02期

本文編號(hào)：2537655