【摘要】：前言 支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞以及它們分泌的各種炎性因子參與的氣道慢性炎癥性疾病,伴有氣道高反應(yīng)、粘液高分泌及可逆性氣流受限,晚期還可出現(xiàn)氣道重塑。Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡被傳統(tǒng)觀念認(rèn)為是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制。Th2細(xì)胞導(dǎo)致嗜酸細(xì)胞性哮喘(Eosinophilic asthma, EA)的發(fā)病。臨床上運(yùn)用一線藥物糖皮質(zhì)激素和(或)p受體激動(dòng)劑能夠控制絕大多數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞哮喘患者的癥狀和提高他們的生活質(zhì)量。但部分患者卻表現(xiàn)出糖皮質(zhì)激素抵抗,這類患者多為中性粒細(xì)胞性哮喘,且病情嚴(yán)重,已成為臨床研究的難點(diǎn)。因此這類患者的生理病理特點(diǎn),疾病的發(fā)病機(jī)制,新的有效的治療靶點(diǎn)和方法成為近年來哮喘領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 近年來新發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞,能很好地解釋"Th2理論”不能解釋的一些實(shí)驗(yàn)和臨床現(xiàn)象。Th17細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素(interleukin-17,IL-17)。IL-17介導(dǎo)的信號(hào)途徑可誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子刺激組織,能招募中性粒細(xì)胞在氣道局部聚集并激活,導(dǎo)致組織浸潤和組織損害。糖皮質(zhì)激素不僅不能抑制中性粒細(xì)胞,反而能增加中性粒細(xì)胞的活性和生存周期。此外,IL-17還參與氣道重塑。已有文獻(xiàn)證實(shí)Th17/IL-17由與哮喘的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。綜上所述,進(jìn)一步從分子水平探討Th17/IL-17軸,尤其是該軸的上游,有望進(jìn)一步了解哮喘的發(fā)病機(jī)制,為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 多巴胺受體可分為Dl類和D2類受體,多巴胺D1類受體與神經(jīng)和精神疾患的關(guān)系已有大量的研究,多巴胺Dl類受體是治療這些精神疾患的一個(gè)重要靶點(diǎn)。最近有研究發(fā)現(xiàn)多巴胺D1類受體還參與免疫疾病的發(fā)病機(jī)制。D1類受體拮抗劑可以抑制Th17和Th2細(xì)胞的分化,促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化,預(yù)防及治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)、治療非肥胖的糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠、能減少小鼠腎毒性血清腎炎(nephrotoxic serum nephritis, NTN)新月體的形成,能減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的炎癥反應(yīng),減少關(guān)節(jié)的損傷。因?yàn)門h2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的過度活化及Th1細(xì)胞的抑制,參與哮喘的發(fā)病,所以,我們推測D1類受體可能通過影響Th17細(xì)胞而參與哮喘的發(fā)病。 首先我們通過分別用D1受體拮抗劑、激動(dòng)劑和生理鹽水干預(yù)小鼠哮喘模型,觀察各組小鼠的一般行為活動(dòng),檢測肺功能,對(duì)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及檢測其IL-17的水平,觀察肺病理切片、用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測脾臟CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例,用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測脾CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-17的水平。通過這些指標(biāo)來觀察Dl受體拮抗劑和激動(dòng)劑對(duì)哮喘小鼠的影響及在體內(nèi)對(duì)Th17/IL-17軸的影響。 我們進(jìn)一步探討D1類受體影響Th17細(xì)胞可能的信號(hào)通路。Nakagome K等認(rèn)為可能是D1類受體激動(dòng)后增加初始CD4+T細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度,促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。此外,D1類受體影響DC分泌IL-23可能亦是其影響Th17細(xì)胞途徑之一。但環(huán)腺苷酸(cyclicadenosine monophosphate, cAMP)為什么能促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化?目前無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將探討cAMP促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的信號(hào)通路。 D1類受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR),它介導(dǎo)經(jīng)典信號(hào)通路Gs/AC/cAMP通路。Zhen等發(fā)現(xiàn)激動(dòng)D1受體可增加胞內(nèi)cAMP的濃度,進(jìn)而激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)。 p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路,可激活核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factor-kappa b, NF-kB)。 NF-kB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可控制BATF基因的轉(zhuǎn)錄。 BATF (B cell activating transcription factor)是近期發(fā)現(xiàn)的AP-1(activator protein1)家族新成員。BATF是Th17細(xì)胞不可缺少的一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子,它參與RORα和RORyt表達(dá)的維持,并且通過直接結(jié)合在IL-17基因的啟動(dòng)子上,和ROγt協(xié)同誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)�；谏鲜�,我們大膽推測,D1類受體可通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。 本研究將在體外探討D1類受體是否通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。首先分離、純化正常小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞并予Th17細(xì)胞定向分化的環(huán)境,同時(shí)分別用D1類受體拮抗劑和激動(dòng)劑干預(yù)。定向分化3天后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例,ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度,免疫蛋白印跡(western blot, WB)檢測RORyt和BATF的表達(dá)。探討了D1類受體對(duì)Th17細(xì)胞分化及對(duì)BATF表達(dá)的影響后,用BATF小干擾RNA (short interfering RNA,siRNA)和對(duì)照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細(xì)胞,再予Th17細(xì)胞定向分化的壞境,同時(shí)加入D1類受體激動(dòng)劑。培養(yǎng)分化細(xì)胞后,用WB檢測BATF的表達(dá),評(píng)估用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,BATF的沉默效果。在檢測到BATF的沉默效果佳后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例,WB檢測RORγt的表達(dá),ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度,觀察D1類受體激活后,BATF基因部分沉默和正常表達(dá)時(shí)Thl7細(xì)胞的分化情況,以期闡明D1類受體影響Th17細(xì)胞分化的信號(hào)通路。 第一章多巴胺D1類受體對(duì)急性哮喘氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響 目的 (1)建立急性哮喘小鼠模型,并鑒定建立的模型是否成功； (2)觀察D1類受體拮抗劑和激動(dòng)劑對(duì)急性哮喘小鼠氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響。 方法 將24只SPF級(jí)BABL/c雌性小鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組(CK)、哮喘組(AS)、D1類受體拮抗劑SCH23390干預(yù)哮喘組(SCH干預(yù)組)和D1類受體激動(dòng)劑SKF83959干預(yù)哮喘組(SKF干預(yù)組)各6只。用OVA致敏、激發(fā)建立急性哮喘模型,正常對(duì)照組以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā),SCH干預(yù)組和SKF干預(yù)組每次霧化前30min均予腹腔注射相應(yīng)的試劑,末次激發(fā)24h后處理所有小鼠：(1)對(duì)小鼠的一般行為活動(dòng)進(jìn)行觀察；(2)收集BALF行細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類,檢測BALF中IL-17的濃度；(3)肺組織病理切片觀察炎癥細(xì)胞浸潤及黏液分泌；(4)研磨各組.小鼠脾臟,制備單個(gè)核細(xì)胞懸液,MACS技術(shù)分離脾臟CD4+T細(xì)胞,計(jì)算脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù),判斷細(xì)胞活力；(5)測定脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度；(6)乙酰甲膽堿激發(fā)小鼠后,有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應(yīng)性。 結(jié)果 (1)正常組小鼠表現(xiàn)正常,哮喘組小鼠出現(xiàn)典型的哮喘樣癥狀,SCH干預(yù)組小鼠癥狀明顯減輕;而SKF干預(yù)組小鼠癥狀有所加重； (2)與正常組相比,哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、Lym、Neu、Eos數(shù)量及IL-17的濃度均顯著增加(均P0.05);SCH干預(yù)組白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組有所降低(P0.05)；而SKF干預(yù)組白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組有所增加(P0.05)； (3)與正常組相比,哮喘組小鼠肺部大量炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生、氣道分泌大量黏液(P0.05)；SCH干預(yù)組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組有所緩解(P0.05)；而SKF干預(yù)組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組加重(P0.05)； (4)與正常組相比,哮喘組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P0.01)；與哮喘組相比,SCH干預(yù)組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P0.01)；與哮喘組相比,SKF干預(yù)組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(P0.01)； (5)與正常組相比,哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度顯著增加(P0.01)；SCH干預(yù)組Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低(P0.01)；而SKF干預(yù)組Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低(P0.01)； (6)與正常組相比,哮喘組氣道反應(yīng)性顯著增高(P0.05)；與哮喘組相比,SCH干預(yù)組小鼠氣道反應(yīng)性有所降低(P0.05),而SKF干預(yù)組氣道反應(yīng)性有所升高(P0.05)。 結(jié)論 (1)本實(shí)驗(yàn)中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的,Th17/IL-17軸參與了哮喘的發(fā)��； (2)D1類受體參與了哮喘的發(fā)病,對(duì)Th17/IL-17軸的調(diào)節(jié)是其中的一個(gè)機(jī)制。 第二章多巴胺D1類受體調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化 目的 (1)探討在體外D1類受體對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響及D1類受體對(duì)BATF表達(dá)的影響； (2)證實(shí)D1類受體通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。 方法 體外實(shí)驗(yàn)分兩部分：第一部分將MACS分離純化獲得的正常小鼠脾CD4+T細(xì)胞分成三組：原液對(duì)照組、D1類受體拮抗齊SCH23390干預(yù)組和D1類受體激動(dòng)劑SKF83959干預(yù)組。每組予Thl7細(xì)胞定向分化的環(huán)境,并予相應(yīng)的試劑干預(yù)。培養(yǎng)分化細(xì)胞后,分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例,ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度,WB檢鋇RORγt和BATF的表達(dá)。 第二部分將正常小鼠脾CD4+T細(xì)胞分成兩組：BATF-siRNA組和對(duì)照siRNA組。首先我們分別用可以沉默BATF表達(dá)的BATF siRNA和對(duì)照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細(xì)胞,再予Th17細(xì)胞定向分化的環(huán)境,同時(shí)加入D1類受體激動(dòng)齊SKF83959。培養(yǎng)分化細(xì)胞后,用WB檢鋇JBATF的表達(dá),評(píng)估用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,BATF的沉默效果。在檢測至BATF的沉默效果佳后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例,WB檢測RORγt勺表達(dá),ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度,觀察D1類受體激活后,BATF基因部分沉默和正常表達(dá)時(shí)Th17細(xì)胞的分化情況。 結(jié)果 (1)與原液對(duì)照組相比,SCH23390干預(yù)組Th17細(xì)胞所占的比例明顯下降(P0.01),而SKF83959干預(yù)組Th17細(xì)胞所占的比例有所升高(P0.01)； (2)與原液對(duì)照組相比,SCH23390干預(yù)組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯下降(P0.01),而SKF83959干預(yù)組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯升高(P0.01)； (3)與原液對(duì)照組相比,SCH23390干預(yù)組RORyt的表達(dá)明顯下降(P0.01),而SKF83959干預(yù)組RORyt的表達(dá)明顯升高(P0.01)； (4)與原液對(duì)照組相比,SCH23390干預(yù)組BATF的表達(dá)明顯下降(P0.01),而SKF83959干預(yù)組BATF的表達(dá)明顯升高(P0.01)； (5) BATF-siRNA組BATF的表達(dá)比對(duì)照siRNA組明顯下降(P0.01); (6) BATF-siRNA組Th17細(xì)胞所占的比例比對(duì)照siRNA組明顯下降(P0.01)； (7) BATF-siRNA組RORyt的表達(dá)比對(duì)照siRNA組明顯下降(P0.01); (8) BATF-siRNA組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度比對(duì)照siRNA組明顯下降(P0.01)。 結(jié)論 (1)在體外D1類受體可調(diào)控Th17細(xì)胞的分化和BATF的表達(dá)； (2)D1類受體可調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2512373