【摘要】：肺發(fā)育相關(guān)疾病如呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome, RDS)、支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)等是新生兒科的常見病、難治病,也是臨床上早產(chǎn)兒、極低出生體重兒死亡的重要病因。RDS是由于肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)分泌不足所致,BPD主要是由于未成熟肺因感染、高氧等多種因素所致肺損傷并出現(xiàn)異常修復(fù),而肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell, AECII)的功能成熟是PS分泌和肺損傷修復(fù)的基礎(chǔ),因此,探索AECⅡ功能成熟及調(diào)控機(jī)制并在其中發(fā)現(xiàn)新的作用機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn),對肺發(fā)育相關(guān)疾病的防治及藥物研發(fā)等可能產(chǎn)生重要影響。AECII是哺乳動物肺泡上皮細(xì)胞的主要組成部分,與肺發(fā)育相關(guān)疾病有著密切聯(lián)系。在功能上,AECII -方面可通過分泌肺表面活性物質(zhì),降低肺泡張力,保持肺的順應(yīng)性；另一方面,AECⅡ還可作為干細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)分化為肺泡I型上皮細(xì)胞(type Ⅰ alveolar epithelial cell, AECI),在肺損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。此外,AECII在維持肺泡內(nèi)外液體平衡及免疫調(diào)節(jié)方面也起著十分重要的作用。因此,AECII發(fā)育不成熟或功能缺陷會導(dǎo)致多種新生兒肺部疾病。目前,尚未建立用于長期研究的正常AECⅡ細(xì)胞株,而來自肺腺癌組織的A549細(xì)胞在功能上并不能完全替代正常的AECII,因而,目前用于研究的AECII大多由成年大鼠肺組織中分離培養(yǎng)而得。由于本課題組的主要研究方向是探討新生兒尤其是早產(chǎn)兒肺部疾病,且孕19天胎鼠肺組織的生物學(xué)特性與早產(chǎn)兒肺組織生物學(xué)特性極為相似,能夠滿足本研究需要。故本課題第一部分主要研究了從孕19天胎鼠肺組織中分離培養(yǎng)AECⅡ的方法,并對分離培養(yǎng)的AECⅡ進(jìn)行了一系列鑒定及分析,尋找其用于體外研究的最佳培養(yǎng)時期。MicroRNA (miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的短小內(nèi)生RNA,它可通過對靶向mRNA的直接降解或抑制轉(zhuǎn)錄而阻止其翻譯、表達(dá),從而在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達(dá)調(diào)控。目前一致認(rèn)為miRNA在細(xì)胞發(fā)育時序、細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干細(xì)胞分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物過程中起著非常重要的作用。MiR-146b是一在脊椎動物中高度保守的miRNA,已有研究證實(shí)它在抑制腫瘤發(fā)展、細(xì)胞分化、增殖等多種生物過程中起著重要作用。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-146b在胎肺發(fā)育晚期不同階段的表達(dá)具有顯著差異性,而胎肺發(fā)育晚期是AECII逐漸成熟并開始具有功能的關(guān)鍵時期,因此,我們推測miR-146b可能對AECII的成熟和功能發(fā)揮有一定影響。為此,我們構(gòu)建了過表達(dá)miR-146b的AECI I,檢測其對AECII曾殖、轉(zhuǎn)分化、表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(surfactant proteins, SPs)表達(dá)的影響,并初步探索了其潛在的作用靶標(biāo),為揭示新生兒肺發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。第一部分胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及ABCA3表達(dá)變化的研究目的： 觀察原代培養(yǎng)胎鼠AECⅡ的生長狀況及特異性蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A3 (ATP binding cassette transporter A3, ABC A3)在不同時間的表達(dá)變化,為新生兒肺發(fā)育及肺部疾病發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法： 首先采用胰酶聯(lián)合膠原酶消化肺組織,并以差速離心及差速貼壁法純化細(xì)胞；隨后分別應(yīng)用電子顯微鏡鑒定AECⅡ細(xì)胞；應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察不同時間點(diǎn)細(xì)胞生長狀態(tài)；并且采用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察ABCA3在不同時間點(diǎn)動態(tài)表達(dá)變化。結(jié)果： 電鏡下觀察到AECⅡ內(nèi)特征性板層小體大小及數(shù)量不等,胞膜外緣分布有刺狀微絨毛；應(yīng)用MTT法測得鋪板后第24h、36h、48h、72h、96h、120h的OD值分別為0.177±0.009,0.193±0.011,0.212±0.019,0.253±0.019,0.243±0.012,0.192±0.011。光學(xué)顯微鏡下可見AECⅡ細(xì)胞形態(tài)隨時間變化而逐漸拉長,變扁平,細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸減少。免疫熒光示ABCA3表達(dá)隨時間變化而逐漸下降。結(jié)論： 原代培養(yǎng)的胎鼠AECⅡ在培養(yǎng)早期(即培養(yǎng)72h以內(nèi))生長狀況最佳,ABCA3表達(dá)最豐富,提示培養(yǎng)早期為研究胎鼠AECⅡ功能及影響機(jī)制較為理想的時間段。第二部分MiR-146b過表達(dá)對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的功能影響及機(jī)制研究目的：探討miR-146b對原代培養(yǎng)AECⅡ生理功能的影響及其潛在的調(diào)控機(jī)制,為新生兒肺發(fā)育調(diào)控機(jī)制的深入研究提供一些理論依據(jù)。方法：首先我們構(gòu)建了包含大鼠miR-146b前體序列及兩側(cè)側(cè)翼序列的miR-146b腺病毒表達(dá)質(zhì)粒載體pAd-GV275 CMV-rno-mir-146b,然后在HEK293T細(xì)胞中包裝表達(dá)miR-146b的腺病毒及不表達(dá)miR-146b的對照腺病毒,再分別感染原代培養(yǎng)的AECII,以等量不含病毒的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的AECII作為空白對照。用real-time PCR法驗(yàn)證過表達(dá)效果后,分別用MTT法、免疫熒光法、real-time PCR和western blot法檢測這三組細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)分化、部分SPs和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)表達(dá)等的差異性。結(jié)果：在AECⅡ培養(yǎng)的第48h和72h時,過表達(dá)miR-146b組的細(xì)胞增殖較空白對照組和陰性對照組有所降低(P0.05)；但免疫熒光顯示于AECⅡ培養(yǎng)的第5天,空白對照組和過表達(dá)miR-146b組ABCA3和水通道蛋白5 (aquaporin 5,AQP5)的表達(dá)無差異性。于AECⅡ培養(yǎng)的第3天,過表達(dá)miR-146b組細(xì)胞的SP-B mRNA表達(dá)較空白對照組和陰性對照組明顯降低(P0.01),但SP-C mRNA和蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05)。此外,在AECⅡ培養(yǎng)第3天時,過表達(dá)miR-146b組細(xì)胞的EGFR mRNA和其蛋白表達(dá)均低于兩組對照組(P0.05)。結(jié)論：MiR-146b負(fù)向調(diào)控原代培養(yǎng)AEC Ⅱ的增殖和SP-B表達(dá),且這種負(fù)向調(diào)控機(jī)制可能與miR-146b下調(diào)EGFR基因有關(guān)。
[Abstract]:Pulmonary development-related diseases such as respiratory distress syndrome (RDS), bronchopulmonary dysplasia (BPD), and the like are common diseases in the newborn, and it is also an important cause of the death of premature infants and very low birth weight infants. RDS is due to the insufficient secretion of pulmonary surfactant (PS), and the BPD is mainly due to the lung injury caused by various factors such as the infection of immature lung and high oxygen, and abnormal repair, while the type II alveolar epeithel cell, The functional maturation of AECII is the basis of PS secretion and lung injury repair. Therefore, it is necessary to explore the mechanism of AEC 鈪，

本文編號：2477709