【摘要】：研究背景急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫癥(ARDS)嚴(yán)重威脅著人民的生命安全。嚴(yán)重的感染(如膿毒癥)是引起ALI/ARDS主要原因之一。盡管目前對ALI/ARDS的研究取得了一定進(jìn)展,但仍無有效的藥物及治療措施,其死亡率仍居高不下。因此深入探究ALI/ARDS炎癥反應(yīng)機(jī)制尋找新的ALI/ARDS的防治靶點顯得尤為重要和迫切。國內(nèi)外研究表明在急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。因此,深入研究巨噬細(xì)胞在這一過程中的作用有望為ALI/ARDS的防治提供新策略、手段。核受體協(xié)同抑制因子(nuclear receptor corepressor,NCOR)是一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子。研究顯示NCo R可通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或抑制NF-κB和AP-1調(diào)節(jié)炎癥。但NCOR如何被調(diào)控,其機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化是高等真核生物基因組中的主要表觀遺傳修飾,其在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化下參與基因調(diào)控從而引起疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題擬采用脂多糖(LPS)誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎癥模型,探討NCOR在炎癥反應(yīng)中的作用及其調(diào)控機(jī)制。研究目的:1.闡明NCOR在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用;2.探討NCOR啟動子甲基化的機(jī)制以及在炎癥反應(yīng)中的作用。研究方法:1.LPS刺激巨噬細(xì)胞對NCOR的表達(dá)及炎癥的影響用1ug/ml的LPS分別處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 24h和48h,Western blot檢測NCOR蛋白的表達(dá)水平,Real time-PCR檢測NCOR、TNF-α、IL-6 mRNA水平。熒光素酶報告基因檢測NF-κB啟動子活性。2.LPS刺激巨噬細(xì)胞對NCOR基因啟動子甲基化的影響LPS刺激細(xì)胞48h后,應(yīng)用MSP檢測NCOR啟動子甲基化情況,Western blot檢測DNMT3b的表達(dá)變化。Real time-PCR檢測5’-aza和LPS聯(lián)合處理細(xì)胞后NCOR mRNA的表達(dá)水平。3.下調(diào)DNMT3b對NCOR及炎癥的影響巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA后,再用LPS處理巨噬細(xì)胞,分別應(yīng)用Western blot和Real time-PCR檢測DNMT3b的表達(dá)水平,以及DNMT3b siRNA和LPS聯(lián)合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平和NF-κB的啟動子活性。結(jié)果:1.LPS刺激細(xì)胞24、48h后,NCOR蛋白和mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05);同時炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平、NF-κB的啟動子活性顯著上升(p0.05)。2.LPS可誘導(dǎo)NCOR啟動子發(fā)生甲基化,DNMT3b蛋白的表達(dá)水平升高,用5’-aza和LPS聯(lián)合處理細(xì)胞后NCOR mRNA水平較LPS組有顯著上升(p0.05)。3.DNMT3b siRNA可顯著下調(diào)DNMT3b蛋白和mRNA水平,升高NCOR表達(dá)水平,從而抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)水平和NF-κB的啟動子活性(p0.05)。結(jié)論:1.LPS刺激巨噬細(xì)胞引起NCOR表達(dá)水平降低,促進(jìn)炎癥。2.LPS通過DNMT3b介導(dǎo)NCOR的啟動子甲基化上調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。3.下調(diào)DNMT3b表達(dá)可通過降低NCOR啟動子甲基化水平進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:Background Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress (ARDS) seriously threaten the lives of people. Severe infections, such as sepsis, are one of the main causes of ALI/ARDS. Although some progress has been made in the study of ALI/ARDS, there are still no effective drugs and treatments, and the mortality rate is still high. Therefore, it is very important and urgent to explore the mechanism of ALI/ARDS inflammation and find a new target for prevention and treatment of ALI/ARDS. Studies at home and abroad have shown that alveolar macrophages play an important role in the development of acute lung injury. Therefore, in-depth study of the role of macrophages in this process is expected to provide a new strategy and means for the prevention and treatment of ALI/ARDS. Nuclear receptor coinhibitor (nuclear receptor corepressor,NCOR is a nuclear inhibitor of transcription. Studies have shown that NCo R can regulate inflammation through TLR4 signal transduction or inhibition of NF- kappa B and AP-1. NCOR methylation is the main epigenetic modification in the genome of higher eukaryotes, and it is involved in gene regulation under the catalysis of DNA methyltransferase (DNMTs), which leads to the occurrence and development of diseases. In this study, we used lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophage inflammation model to explore the role of NCOR in inflammatory response and its regulatory mechanism. Research purposes: 1. To clarify the role of NCOR in the inflammatory response induced by LPS; 2. To explore the mechanism of NCOR promoter methylation and its role in inflammatory reaction. Methods: the effects of 1.LPS stimulated macrophages on the expression of NCOR and inflammation were studied. RAW264.7 was treated with 1ug/ml LPS for 24 h and 48 h, respectively. Western blot was used to detect the expression of NCOR protein and Real time-PCR was used to detect NCOR,TNF- 偽. IL-6 mRNA level. NF- 魏 B promoter activity was detected by luciferase reporter gene assay. 2. Effects of LPS-stimulated macrophages on methylation of NCOR gene promoter in LPS-stimulated cells 48 hours later, NCOR promoter methylation was detected by MSP. The expression of DNMT3b was detected by Western blot. The expression level of NCOR mRNA was detected by Real time-PCR after co-treatment with 5'-aza and LPS. 3. Down-regulate the effect of DNMT3b on NCOR and inflammation after macrophages were transfected with DNMT3b siRNA, then treated with LPS, the expression of DNMT3b was detected by Western blot and Real time-PCR respectively, and NCOR,TNF- 偽 was induced by DNMT3b siRNA and LPS. IL-6 expression level and NF- 魏 B promoter activity. Results: after stimulated by 1.LPS for 24 h and 48 h, the expression of NCOR protein and mRNA were significantly down-regulated (p0.05). At the same time, the expression of TNF- 偽 and IL-6 mRNA and the activity of NF- 魏 B promoter increased significantly (p0.05). 2.LPS induced the methylation of NCOR promoter and the expression level of DNMT3b protein. After treated with 5'-aza and LPS, the level of NCOR mRNA was significantly higher than that of LPS group (p0.05). 3.DNMT3b siRNA significantly down-regulated the levels of DNMT3b protein and mRNA, increased the expression of NCOR, and thus inhibited the expression of TNF- 偽. IL-6 expression level and NF- 魏 B promoter activity (p0.05). Conclusion: lipopolysaccharide (1.LPS) stimulates macrophages to decrease the expression of NCOR and promote inflammation. 2.LPS mediated NCOR promoter methylation through DNMT3b to up-regulate macrophage inflammatory reaction. Down-regulation of DNMT3b expression can inhibit macrophage inflammatory response by decreasing methylation level of NCOR promoter.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.8

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本文編號：2470346