發(fā)布時(shí)間：2019-03-15 10:16

【摘要】：第一部分COPD患者肺組織中Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化及其與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系 目的：檢測(cè)比較非吸煙非COPD患者、吸煙非COPD患者及吸姻并COPD患者肺組織樣本間Bcl-2基因甲基化位點(diǎn)、Bcl-2表達(dá)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的變化,并分析它們之間的關(guān)系,探討B(tài)cl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在COPD發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法：收集2007年9月至2011年2月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胸外科行全麻下肺葉切除術(shù)或肺段切除術(shù)的周圍型肺癌31例,所有患者的病理類型均為非小細(xì)胞肺癌。根據(jù)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)及吸煙習(xí)慣將其分成三組：非吸煙非COPD組10例、吸煙非COPD組10例、吸煙并COPD組(穩(wěn)定期)11例。TUNEL法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá),Western-blot及real-time RT PCR檢測(cè)肺組織Bcl-2、Bax、cyt C表達(dá),采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BSP)進(jìn)行甲基化水平評(píng)估和測(cè)序。各組計(jì)量資料以(Mean±SD)表示,采用Anova檢驗(yàn)比較呈正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),LSD-t檢驗(yàn)正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較；采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較非正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),采用Nemenyi檢驗(yàn)非正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較；部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)間作單因素直線相關(guān)分析及多元線性回歸分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：吸煙并COPD(穩(wěn)定期)組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(22.79±5.30)%較其他兩組非COPD患者增高(P0.01)。該組的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率為(5.18±3.76)%,較其他兩組非COPD患者明顯下降(P0.01)。COPD組患者肺組織Bcl-2蛋白、mRNA的相對(duì)表達(dá)量和Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分別為0.31±0.11、0.14×10-3.4±0.02×10-3、(12.23±4.39)%,吸煙非COPD組肺組織Bcl-2蛋白、mRNA的相對(duì)表達(dá)量、啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分別為0.634±0.13、1.58×10-3±0.26x10-3、(1.45±1.15)%,非吸煙非COPD組肺組織Bcl-2蛋白、mRNA的相對(duì)表達(dá)量和Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分別為0.62±±0.12、1.70×10-3±0.16×10-3、(1.64±0.16)%;COPD組患者肺組織Bc1-2相對(duì)表達(dá)量均較非COPD組明顯下降,而Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均較非COPD組上升(均P0.01)。Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化,有50%的異常甲基化發(fā)生在位于-127bp的CpG中的C位點(diǎn)COPD組肺組織Bax蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.04和1.38×10-3±0.21×10-3,吸煙非COPD組肺組織Bax蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.13和0.27×10-3±0.03×10-3,非吸煙非COPD組肺組織Bax蛋白、mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.11和0.26×10-3±0.02×10-3; COPD組患者肺組織Bax相對(duì)表達(dá)量均較非COPD組明顯上升(均P0.01)。COPD組肺組織胞漿cyt C蛋白表達(dá)均較非COPD組明顯上升(P0.01),但整體cyt C mRNA各組間并無(wú)明顯差異(P0.05)。相關(guān)性分析顯示肺組織Bcl-2的蛋白表達(dá)與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.78,P0.01),與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)(r=-0.76,P0.05)；Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.70,P0.01,圖1-27),與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.83,P0.01) 結(jié)論：1.COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,肺組織的Bax表達(dá)上升,肺組織及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)下降。2.COPD患者肺內(nèi)Bcl-2表達(dá)下降,可能導(dǎo)致線粒體依賴的凋亡途徑激活,出現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,參與COPD的疾病過(guò)程。3.COPD患者肺組織Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常甲基化,位于-127bp的CpG中的C位點(diǎn)為異常甲基化好發(fā)部位。4.吸煙可能通過(guò)誘發(fā)Bcl-2基因啟動(dòng)區(qū)異常甲基化,從而影響B(tài)cl-2蛋白表達(dá),進(jìn)而參與COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。5.人群間對(duì)吸煙可能誘導(dǎo)的Bcl-2啟動(dòng)區(qū)異常甲基化具有不同的易感性。 第二部分肺氣腫動(dòng)物模型的肺組織中Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化及其與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系 目的：檢測(cè)比較香煙提取物腹腔注射構(gòu)建肺氣腫動(dòng)物模型、對(duì)照動(dòng)物模型、去甲基化干預(yù)動(dòng)物模型的肺組織樣本間Bcl-2基因甲基化位點(diǎn)、Bcl-2表達(dá)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的變化,并分析它們之間的關(guān)系,探討B(tài)cl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在COPD發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法：BALB/C小鼠40只分成四組造模,每組10只。PBS組于第1、11、15、17、19、22天經(jīng)腹腔注射PBS緩沖液(0.01M,PH7.2-7.4)0.3ml; CSE組于第15、17、19天經(jīng)腹腔注射PBS緩沖液(0.01M,PH7.2-7.4)0.3ml,第1,11,22天經(jīng)腹腔注射CSE0.3ml; CSE+AZA組于第1、11、22天經(jīng)腹腔注射CSE0.3ml,第15、17、19天經(jīng)腹腔注射AZA,每次注射AZA量=2.5mg/kg×小鼠體重;AZA組于第1,11,22天腹腔注射PBS緩沖液0.3ml,第15、17、19天經(jīng)腹腔注射AZA,每次注射AZA量=2.5mg/kg×小鼠體重；第28天停止實(shí)驗(yàn)。TUNEL法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡指數(shù),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá),Western-blot及real-time RT PCR檢測(cè)肺組織Bcl-2、Bax、cyt C表達(dá)。各組計(jì)量資料以(Mean±SD)表示,采用Anova檢驗(yàn)比較呈正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),LSD-t檢驗(yàn)正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較；采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較非正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),采用Nemenyi檢驗(yàn)非正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較;部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)間作單因素直線相關(guān)分析及多元線性回歸分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：CSE組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(25.88±7.55)%較其他三組明顯增高(P0.01)。該組的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率為0.35+0.11,較其他三組動(dòng)物模型明顯下降(P0.01)。COPD組患者肺組織Bcl-2蛋白、mRNA的相對(duì)表達(dá)量和Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分別為0.49±0.10、2.46×10-3±1.02×10-3、(35.68±5.99)%,較其他三組Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào),啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度升高明顯(P0.05)。最易發(fā)生異常甲基化的CpG位點(diǎn)為5'起始的第二、八個(gè)CpG位點(diǎn)(一1884bp.一1740bp)；有26.67%的甲基化發(fā)生在這兩個(gè)位點(diǎn)。CSE組肺組織Bax蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.49+0.11和1.01×10-3+0.34×10-3,胞漿cyt C蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.49+0.11,均較正常對(duì)照組改變明顯(均P0.01)。但AZA可以逆轉(zhuǎn)CSE導(dǎo)致的Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平上升、Bcl-2下調(diào)、Bax表達(dá)增加、凋亡增加等變化,且CSE+AZA組Bcl-2.Bax及胞漿cyt C表達(dá)同對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。相關(guān)性分析顯示肺組織Bcl-2的蛋白表達(dá)與胞漿cyt C表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.48,P0.01),肺組織及非血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均呈負(fù)相關(guān),r(肺組織)=-0.96,r(肺血管內(nèi)皮細(xì)胞)=-0.97,均P0.01；且與動(dòng)物肺功能多個(gè)指標(biāo)相關(guān)。Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與肺組織及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),r(肺組織)=-0.91,r(肺血管內(nèi)皮細(xì)胞)=-0.96,均P0.01；與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.95,P0.01) 結(jié)論：1.CSE腹腔注射建立的肺氣腫模型中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,肺組織的Bax表達(dá)上升,肺組織及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)下降。2.CSE腹腔注射建立的肺氣腫模型中肺內(nèi)Bcl-2表達(dá)下降,可能通過(guò)激活線粒體依賴凋亡途徑,導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,最終參與COPD的疾病過(guò)程。3.CSE腹腔注射建立的肺氣腫模型中Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常甲基化,異常甲基化的好發(fā)位點(diǎn)為-1784bp、-1705bp的CpG中C位點(diǎn)。4.去甲基化干預(yù),AZA腹腔注射能夠逆轉(zhuǎn)CSE導(dǎo)致的Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。5.香煙暴露引起B(yǎng)cl-2啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常甲基化,進(jìn)而Bcl-2蛋白表達(dá)下降,并可能導(dǎo)致cyt C釋放入胞漿——肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體依賴凋亡通路啟動(dòng),最終出現(xiàn)COPD。 第三部分Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在CSE誘導(dǎo)HUVEC凋亡中的作用 目的：研究CSE誘導(dǎo)HUVEC凋亡的可能機(jī)制,并探索Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在凋亡過(guò)程中扮演的可能角色。 方法：體外培養(yǎng)HUVEC,給予不同濃度(0%-20%)和不同時(shí)間(Oh-12h)的CSE干預(yù),采用Annexin V-FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率,免疫細(xì)胞化學(xué)法、Western-blot及realtime-RT PCR檢測(cè)Bcl-2表達(dá)。進(jìn)一步將HUVEC分為四組：空白組,CSE(5%)組,AZA+CSE組,AZA組,分別給予不同的干預(yù)。檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)法、Western-blot及realtime-RT PCR檢測(cè)Bcl-2表達(dá),BSP法檢測(cè)各組Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及水平。采用Anova檢驗(yàn)比較呈正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),LSD-t檢驗(yàn)正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較；采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較非正態(tài)分布的多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù),采用Nemenyi檢驗(yàn)非正態(tài)分布的樣本均數(shù)間的多重比較；部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)間作單因素直線相關(guān)分析及多元線性回歸分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：CSE孵育2h后,HUVEC凋亡呈時(shí)間依賴模式。5%CSE干預(yù)2h后的凋亡率達(dá)到(3.13+0.68)%。此后隨著CSE濃度繼續(xù)增加,凋亡率也增加,但細(xì)胞壞死也逐漸明顯。10%CSE干預(yù)12h后HUVEC凋亡達(dá)到最高峰(46.13+5.07)%。與凋亡相反,隨著CSE干預(yù)濃度的增加,Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低。5%CSE干預(yù)12h后HUVEC凋亡率為(23.77±3.40)%,較0%及2.5%CSE組明顯上升；而Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.16+0.05,較0%及2.5%CSE組明顯下降(P0.01)。去甲基化試劑AZA干預(yù)能夠改善受損的Bcl-2表達(dá),并降低細(xì)胞凋亡率(P0.01)。BSP進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CSE組Bcl-2基因啟動(dòng)區(qū)發(fā)生異常甲基化,甲基化水平為(14.55+3.15)%,而AZA干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)或預(yù)防Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化(P0.01)。最易發(fā)生異常甲基化的位點(diǎn)為5'起始的第九個(gè)CpG (+5bp)的C位點(diǎn)；有33.33%的甲基化發(fā)生在該位點(diǎn)。相關(guān)性分析則發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)同胞漿cyt C蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平也呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論：(1)CSE誘導(dǎo)的HUVEC凋亡可能通過(guò)線粒體依賴的凋亡途徑啟動(dòng)。(2)CSE可能通過(guò)誘導(dǎo)Bcl-2甲基化而下調(diào)Bcl-2表達(dá),從而下降線粒體膜穩(wěn)定性,導(dǎo)致cyt C線粒體釋放入胞漿,激發(fā)凋亡,最終HUVEC凋亡增加。(3)香煙暴露是多種疾病的危險(xiǎn)因素,同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能夠良好模擬人內(nèi)皮細(xì)胞,提示CSE干預(yù)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自身Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能參與多種內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)疾病,如COPD、冠心病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 季紅斌,翟琦巍,劉新垣,鄭仲承;bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2000年02期

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本文編號(hào)：2440543