本文關(guān)鍵詞：靶向沉默ITGB4對(duì)TLR4通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中南大學(xué)》 2014年

靶向沉默ITGB4對(duì)TLR4通路的影響

王亞琦  

【摘要】：哮喘(asthma)是以AHR、上皮結(jié)構(gòu)性損傷、氣道慢性炎癥等為臨床表型和病理特征的呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)疾病,表現(xiàn)為呼吸道對(duì)一般性理化刺激或藥物、內(nèi)源性免疫或炎癥介質(zhì)等過(guò)度反應(yīng),對(duì)病原微生物及毒性氣體的抵抗力降低,易發(fā)生氣道阻力增高和反復(fù),哮喘的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚,公認(rèn)的有免疫反應(yīng)失平衡和過(guò)敏原學(xué)說(shuō)、神經(jīng)源性氣道炎癥理論及氣道上皮缺陷等。早期的研究顯示,哮喘病人氣道上皮的病理改變與哮喘的局部免疫炎癥反應(yīng),氣道重構(gòu)及糖皮質(zhì)激素的治療效果等密切相關(guān)。歐洲呼吸病雜志(Journal of European Respiration)多次明確將哮喘歸類于一類氣道上皮性疾病�！度蛑夤芟乐纬h》(Global Initiative for Asthma,GINA)明確指出,支氣管上皮功能不良在哮喘發(fā)病機(jī)理中的作用和Ig E介導(dǎo)的機(jī)制同等重要,應(yīng)予關(guān)住。 本室前期研究應(yīng)用基因芯片篩選了人外周血白細(xì)胞差異表達(dá)的粘附分子,發(fā)現(xiàn)integrin04在哮喘病人中表達(dá)下調(diào)。 Toll樣受體1是單個(gè)的跨膜非催化蛋白,是天然免疫與獲得性免疫的橋梁,參與急性炎癥與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),TLRs可以識(shí)別多種微生物源的分子,即病原體相關(guān)分子模式,通過(guò)誘導(dǎo)編碼細(xì)胞因子基因,如TNF-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄而激活炎癥。其中,TLR4具有普遍適用性。 本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明了integrin β4在哮喘病人的氣道粘膜表達(dá)降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默integrin β4影響了HBECs的抗原提呈過(guò)程,使得上皮細(xì)胞激活Thl通路受到抑制。我們猜想integrin β4沉默可能影響Toll樣受體在氣道上皮的表達(dá),從而進(jìn)一步與氣道局部的免疫失平衡密切相關(guān)。因此,本課題將主要研究integrin β4沉默對(duì)HBECs中TLR4表達(dá)及TLR4下游兩條重要信號(hào)通路的影響。 目的： 觀察integrin β4沉默對(duì)HBECs中TLR4表達(dá)的影響,及TLR4下游兩條重要信號(hào)通路的影響。同時(shí),研究integrin β4對(duì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化的作用,以及由此引起免疫失平衡,從而對(duì)引起哮喘發(fā)病的免疫學(xué)理論進(jìn)行初步的探討。 方法： (1)設(shè)計(jì)并合成integrin β4siRNA,并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HBECs中。通過(guò)熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別從RNA和蛋白水平檢測(cè)integrin β4的表達(dá)。 (2)MTT法確定LPS的最佳給藥濃度。 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組TLR4的改變。 (4) Western blot法檢測(cè),在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組MyD88, TRIF的改變,反映integrin β4分別對(duì)TLR4下游分子的影響。 (5)ELISA法檢測(cè),在LPS分別作用24h,48h,72h后,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組中TNF-α, IFN-β的改變,進(jìn)一步檢測(cè)integrin β4分別對(duì)TLR4兩條信號(hào)通路的影響。 (6)正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組,分別受LPS刺激6h,與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72h,收集細(xì)胞上清液,ELISA法檢測(cè)IFN-γ, IL-4,IL-17分泌量,觀察integrin β4對(duì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果： (1)成功合成integrin β4siRNA,并轉(zhuǎn)染]HBECs。熒光顯微鏡下觀察,siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90%。與Control siRNA組相比,轉(zhuǎn)染integrin β4siRNA的HBECs中,integrin β4在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)均顯著下降 (2)LPS作用HBECs的最佳給藥濃度為1μg/mL。 (3)LPS刺激使得HBECs中TLR4的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TLR4的表達(dá)升高更明顯。 (4)LPS刺激使HBECs中MyD88, TRIF的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,MyD88, TRIF的增加趨勢(shì)更明顯。 (5)LPS刺激使HBECs中TNF-α和IFN-β的表達(dá)顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TNF-α和IFN-β的增加更明顯。與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24h,48h,72h TNF-α的分泌量變化不明顯,然而IFN-β的分泌量在24h,48h升高不明顯,72h時(shí)明顯增高。 (6)較正常HBECs組和Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組可以明顯升高與之共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞對(duì)IL-4,IL-17的分泌,對(duì)IFN-γ的分泌量無(wú)明顯變化。在LPS作用下,LPS組較LPS陰性組相比,IFN-γ的分泌量明顯升高,IL-4和IL-17的分泌量無(wú)明顯差異。 結(jié)論： (1)通過(guò)RNA干擾技術(shù)能有效沉默integrin β4,成功構(gòu)建integrin β4細(xì)胞模型。 (2)靶向沉默integrin β4可以明顯促進(jìn)TLR4的表達(dá),激活TLR4下游兩條信號(hào)通路,同時(shí)對(duì)MyD88依賴信號(hào)通路激活發(fā)24h,對(duì)MyD88非依賴信號(hào)通路激活發(fā)生在72h。 (3)靶向沉默integrin β4促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化,平衡向Th2方向漂移,同時(shí),誘導(dǎo)Th17型炎癥發(fā)生。LPS在給藥濃度為1μg/mL時(shí),可以誘導(dǎo)Thl型免疫發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

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10 葉楓;Chungho Kim;Mark Ginsberg;;Talin Activates Integrins by Altering the Topology of the β Transmembrane Domain[A];生命的分子機(jī)器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要集[C];2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 李勇;HAb18G/CD147與integrinβ1亞基相互作用調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞惡性行為及放療抵抗的機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 肖潤(rùn);Integrin激活c-Src的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[D];上海交通大學(xué);2013年

3 鄭宏宇;整合素基因αV和β3在DVT中表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)及臨床研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

4 何建明;Integrin αⅤ在結(jié)腸癌群集耐藥中作用及機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

5 劉宇;β1-整合素介導(dǎo)激活蛋白激酶C-α促進(jìn)肝癌細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子κB表達(dá)及侵襲和轉(zhuǎn)移[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 喬婷;大鼠正畸牙移動(dòng)中Integrin-αm表達(dá)變化的研究[D];青島大學(xué);2011年

2 鄒麗琴;integrin β1對(duì)rMSCs增殖和分化影響的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

3 王潔;PGE_2通過(guò)NF-κB信號(hào)通路上調(diào)肝癌細(xì)胞β1-integrin表達(dá)的機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

4 甘衛(wèi)剛;Integrinβ_1、VEGF和MVD在下咽鱗癌組織中的表達(dá)及其意義[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

5 常永麗;整合素β4對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞免疫信號(hào)傳遞的影響[D];中南大學(xué);2012年

6 王亞琦;靶向沉默ITGB4對(duì)TLR4通路的影響[D];中南大學(xué);2014年

7 李冰潔;不孕患者子宮內(nèi)膜息肉組織中CTGF、Integrin-β1、ER、PR蛋白的表達(dá)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

8 孫見(jiàn)微;Integrinβ3，，Survivin在CINⅢ及宮頸鱗癌中的表達(dá)及對(duì)宮頸鱗癌化療的意義研究[D];暨南大學(xué);2012年

9 周倩男;整合素α4integrin與連接蛋白LPXN之間的相互關(guān)系及LPXN對(duì)細(xì)胞黏附的作用[D];華中科技大學(xué);2013年

10 李怡寧;P63、integrinβ1在涎腺干細(xì)胞發(fā)育中的作用及其與涎腺腫瘤發(fā)生的關(guān)系[D];四川大學(xué);2004年

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本文編號(hào)：243577