發(fā)布時間：2018-11-17 20:06

【摘要】：[研究目的] 肺纖維化是一種難治性、具有高死亡率的肺間質性疾病,特征為肺泡壁(肺泡炎)受損,成纖維細胞/肌成纖維細胞異常聚集,膠原和其他細胞外基質的過度沉積,異常組織修復導致肺功能喪失。肺纖維化的發(fā)病原因及機制并不清楚,但肺纖維化引起不可逆性的肺功能障礙和呼吸衰竭,造成非常嚴重的致死性結果。臨床試驗證實,激素和非激素免疫抑制劑、抗纖維化、抗細胞因子及免疫調節(jié)等藥物對治療肺纖維化無明確療效。肺移植是目前治療終末期肺纖維化的唯一有效方法。 肺纖維化發(fā)病機制的研究一直是國內外醫(yī)學界研究熱點和難點。以往對肺纖維化發(fā)病機制的研究主要集中在對調節(jié)分泌膠原蛋白的成纖維細胞的增殖、活化和分化方面。近年研究發(fā)現,多種致炎癥介質(TNF、IL-1β、CXCL1、MIP-2. PDGF和TGF-β1等)、氧化應激和抑制炎癥介質(PGE2、COX-2)在肺纖維化的形成中起著重要作用。 在過去的幾年,趨化因子、趨化因子受體和趨化因子受體信號及整合蛋白α3β1、WNT1誘導信號蛋白1(WISP-1)及PI3K-AKT-S6K1和Wnt-βcatenin信號通路已被作為目前抗肺纖維化治療研究的干預作用靶點。 T淋巴細胞在肺纖維化的形成中起到重要作用已被目前研究證實,目前主要集中在Th1/Th2細胞的失衡與調節(jié)性T淋巴細胞。新近研究發(fā)現,一群不同于Th1、Th2、Treg的細胞亞群,它們不表達IL-4或IFN-γ,卻高水平分泌IL-17,被命名為Th17細胞。Th17細胞通過分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-γ等細胞因子發(fā)揮效應功能,在自身免疫病、感染等疾病中發(fā)揮重要的作用已經被證實。Th17細胞及其分泌的IL-17A被認為與肺纖維化發(fā)生有關,但在肺纖維化的發(fā)病機制中的作用報道較少,具體的機制也并未闡述。 綜上所述,為了研究肺纖維化發(fā)病的機制,我們推測Th17細胞及IL-17在肺纖維化發(fā)病機制中可能起到重要作用。為了證明這一假說,本研究擬從以下幾個方面進行研究：①Th17細胞分泌IL-17在博來霉素致肺纖維化中的作用；②Th17細胞分化在肺纖維化中的作用；③IL-17對體外肺成纖維細胞的增殖、轉化和分泌作用；④IL-17對體外siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞和NF-κB通路的作用。研究闡明Th17細胞及IL-17在肺纖維化形成中的作用機制,可為肺纖維化治療提供新的策略和干預作用的細胞和分子靶點。 [研究方法] 1.Th17細胞分泌IL-17在博來霉素致肺纖維化中的作用研究方法：①博來霉素致小鼠肺纖維化模型制備。隨機分為2組正常組和博萊霉素組(n=20),采用直視下氣管內注入博萊霉素(0.05ml,5mg/kg),正常組注入同體積的生理鹽水,分別于3、7、14、28天處死；②HE染色和Masson染色評價肺組織病理形態(tài)學改變；③生物化學方法測定小鼠肺組織羥脯氨酸含量；④免疫組織化學方法測定肺組織IL-17A蛋白的表達和定位；⑤RT-PCR方法測定IL-17AmRNA的表達；⑥流式細胞技術測定脾淋巴細胞Thl7的表達。 2.Th17細胞分化在肺纖維化中的作用研究方法：①博來霉素致小鼠肺纖維化模型制備。隨機分為3組,正常組、博萊霉素組和全反式維甲酸組(n=5),采用直視下氣管內注入博萊霉素(0.05ml,5mg/kg),正常組注入同體積的生理鹽水,全反式維甲酸組第0天氣管內注射博萊霉素5mg/kg,同時予腹腔注射全反式維甲酸0.5mg/只,每周三次。三組均于28天處死；②HE染色和Masson染色評價肺組織病理形態(tài)學改變；③生物化學方法測定小鼠肺組織羥脯氨酸含量；④RT-PCR方法和免疫組織化學方法測定肺組織IL-17AmRNA和蛋白的表達；⑤RT-PCR方法測定TGF-β、IL-10、IL-6mRNA的表達；⑤流式細胞技術測定脾淋巴細胞Th17和CD4+CD25+T細胞的表達。 3.IL-17對體外肺成纖維細胞的增殖、轉化和分泌作用研究方法：①博萊霉素誘導肺纖維化模型的建立,分別于3、7、14、28天處死。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IL-17ARmRNA在肺纖維化形成中表達的變化,選擇表達IL-17ARmRNA最佳時間的肺成纖維細胞進行原代培養(yǎng)和激光共聚焦顯微鏡下觀察波型蛋白鑒定。②IL-17與肺成纖維細胞共培養(yǎng)分別觀察24h、48h和72h,使用四氮唑藍比色法(MTT)檢測不同濃度的IL-17對肺成纖維細胞的增殖,明確最佳刺激濃度。③免疫熒光、RT-PCR和Western Blotting檢測肌成纖維細胞標志物a-SMA。④RT-PCR和Western Blotting檢測IL-17對肺成纖維細胞Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達。 4.IL-17對體外siRNA-Actl轉染肺成纖維細胞和NF-KB通路作用的研究方法： ①陽離子脂質體法轉染siRNA-Act1進入肺成纖維細胞,確定轉染的最佳濃度和干擾時間；②熒光定量PCR和western blotting方法鑒定Act1干擾效率；③實驗分成3組,空白組(.IL-17-siRNA-Act1),對照組(+IL-17-siRNA-Act1),干擾組(+IL-17+siRNA-Act1)。四氮唑藍比色法比較IL-17對肺成纖維細胞和siRNA-Actl轉染肺成纖維細胞的增殖效果；③免疫熒光和Western Blotting檢測肌成纖維細胞標志物a-SMA；④Western Blotting檢測肺成纖維細胞Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的表達；⑤IL-17與肺成纖維細胞和siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞共培養(yǎng),分別于0min,15min,30min和60min熒光定量PCR檢測P65、IκB和Act1mRNA的表達,western blotting方法檢測P65、p-P65、IKB、p-IκB和Act1蛋白表達 [研究結果] 1.Th17細胞分泌IL-17A在博來霉素致肺纖維化中的作用結果：①成功構建博來霉素誘導肺纖維化模型,HE染色示肺泡炎在14d達高峰,Masson染色及羥脯氨酸測定反應肺纖維化均在28d最明顯。②IL-17A定位在終末支氣管、呼吸性細支氣管和肺泡上皮。③IL-17A在第7d表達開始增加,14d達到高峰,28d有所下降,但均高于正常組。④脾淋巴細胞CD4+IL-17+T/CD4+T量變化規(guī)律與IL－17A表達量相同。 2.Th17細胞分化在肺纖維化中的作用結果：①全反式維甲酸能抑制IL-17+CD4+T細胞分化和促進CD4+CD25+Treg的分化和抑制IL-17蛋白和mRNA的表達,降低脯氨酸含量,減輕博來霉素致小鼠肺纖維化程度；②全反式維甲酸能抑制小鼠肺纖維化組織TGF-p和IL-6mRNA表達,而對IL-10的表達無明顯作用。 3.IL-17對體外肺成纖維細胞的增殖、轉化和分泌作用結果：①IL-17AR mRNA在博來霉素誘導肺纖維化形成中表達增加,14d達高峰；②IL-17能明顯促進肺成纖維細胞的增殖、轉化和膠原的合成。 4.IL-17對體外siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞和NF-κB通路的作用結果：①25pmol濃度和培養(yǎng)48h時為siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞最佳劑量和時間點；②siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞Act1蛋白表達降低；③IL-17不能明顯促進siRNA-Act1轉染的肺成纖維細胞增殖、轉化和膠原合成。④IL-17作用于siRNA-Act1非轉染肺成纖維細胞,通過P65和IκB的磷酸化,激活NF-κB通路；IL-17作用于siRNA-Actl轉染肺成纖維細胞Act1蛋白表達降低,抑制P65和IκB的磷酸化,從而抑制NF-κB通路。 [研究結論] 1.Th17細胞所分泌的IL-17A參與博來霉素致小鼠肺纖維化形成。 2.IL-17A參與肺纖維化形成,可能與TGF-β、IL-6表達增加促進IL-17+CD4+T分化和抑制CD4+CD25+Treg的分化有關。 3.全反式維甲酸可通過抑制TGF-β和IL-6表達,調節(jié)Th17與Treg細胞分化,降低IL-17的表達,減輕肺纖維化作用。 4.IL-17具有促進肺成纖維細胞的增殖、轉化和合成膠原作用。 5. siRNA-Act1轉染肺成纖維細胞,Act1蛋白表達降低,IL-17對siRNA-Act1轉染的肺成纖維細胞增殖、轉化和膠原合成無明顯促進作用。 6.IL-17作用于肺成纖維細胞,通過促進P65和IKB的磷酸化,激活NF-κB通路。 7.IL-17對肺成纖維細胞作用,可能通過結合Act1蛋白,激活NF-κB通路有關；干擾Act1蛋白表達,抑制NF-κB通路,降低了IL-17對肺成纖維細胞的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R563.9

【共引文獻】

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本文編號：2338905