【摘要】：白介素-32(IL-32)最早發(fā)現(xiàn)于1992年,是NK細胞、上皮細胞所分泌的一種細胞因子,但此后對于其研究并未取得明顯進展,直到2005年才被正式命名為IL-32,是目前發(fā)現(xiàn)的最新的細胞因子之一。目前的研究表明IL-32在免疫缺陷癥、潰瘍性結腸炎、克羅恩、類風濕等疾病均有異常表達,在呼吸系統(tǒng)疾病,IL-32在肺結核、肺癌、哮喘及慢性阻塞性肺疾病(COPD)也均有異常表達。研究證明人體內存在γ-干擾素(INF-γ)——IL-32——白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)正反饋通路,COPD患者尤其慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)患者,該通路被激活,IL-32表達明顯增加;國內外研究表明,硝苯地平、辛伐他汀、布地奈德等藥物能抑制哮喘中的IL-32的表達,從而發(fā)揮抗炎作用,減輕哮喘急性發(fā)作的次數(shù)及嚴重程度,國外研究還表明布地奈德也能抑制COPD中IL-32表達。國內外的研究認為IL-32主要通過絲裂原活化蛋白激酶P38(P38MAPK)磷酸化途徑、核因子-?b(NF-?b)途徑、Caspase途徑等激活下游新號通路,上調腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、白介素-8(IL-8),白介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達,參與了COPD的炎癥反應,目前研究證實INF-γ——IL-32——IL-1β通過調節(jié)TGF-β、VEGF等的表達參與COPD的氣道重塑過程及肺氣腫的形成。糖皮質激素(GC)因為其廣泛的有效的的抗炎作用,是治療COPD最主要的藥物,但其療效遠不如哮喘,目前認為導致這一結果原因是糖皮質激素抵抗,早期的研究認為糖皮質激素抵抗的主要原因是GR異常所致,大量資料表明糖皮質激素抵抗患者及動物模型均檢測到糖皮質激素受體(GR)表達降低。而最新研究表明人體GR受體存在α、β兩種亞型,GRα是發(fā)揮糖皮質激素效應的靶受體,而GRβ則是一種糖皮質激素效應的內源性拮抗劑,在激素抵抗型的哮喘及血液病的患者中,檢測到GRα表達下調、GRβ表達上調,因此GRα/GRβ失衡是糖皮質激素抵抗的重要原因。少數(shù)研究表明INF-γ——IL-32——IL-1β通過NF-?b/AP-1通路參與GRα、GRβ等表達,通過上調GRβ表達,下調GRα表達,參與了糖皮質激素抵抗�？死顾厥且环N大環(huán)內酯類藥物,已經被廣泛用于穩(wěn)定期COPD的治療,研究表明:克拉霉素可以降低穩(wěn)定期COPD患者TNF-α,IL-8,IL-6等炎癥因子的表達,抑制肺部炎癥,提高運動耐力,改善肺功能�？死顾氐脑贑OPD中抗炎作用已經被公認,但是關于克拉霉素治療COPD中的機制,國內外研究雖然較少,克拉霉素是否通過INF-γ——IL-32——IL-1β通路調節(jié)下游炎癥因子的表達,從而發(fā)揮治療COPD作用,克拉霉素是否通過INF-γ——IL-32——IL-1β調節(jié)NF-?b/AP-1,影響GRα、GRβ的表達,從而逆轉糖皮質激素抵抗,國內外尚未見類似研究,本研究意在探克拉霉素下調IL-32表達對COPD大鼠糖皮質激素抵抗的影響及機制。材料與方法健康的雄性SD大鼠50只,體重180±20g。隨機分為:空白組(10只)、模型組(40只)。模型組:第1、31、61天經氣管插管后氣道內滴入脂多糖,第2~30、32~60、62~90天在熏煙箱中被動吸煙。健康對照組:第1、31、61天經氣管插管后氣道內滴入生理鹽水,第2~30、32~60、62~90天在熏煙箱中呼吸空氣。模型構建完成后,將模型組隨機分為4組,即COPD組,克拉霉素中,布地奈德組,聯(lián)合干預組,每組10只。COPD組:第91天開始給予生理鹽水灌胃,1次/日,2ml/只,共30天�？死顾亟M:第91天開始給予克拉霉素灌胃,1次/日,50mg/kg,共30天。布地奈德組:第91天開始霧化吸入布地奈德,1次/日,1mg/只,共30天。聯(lián)合干預組:第91天開始給予克拉霉素灌胃,劑量及時間同上,霧化吸入布地奈德,劑量及時間同上。第121天檢測肺功能,留取血液及肺泡灌洗液,使用ELISA法檢測血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平;部分肺組織進行HE染色后觀察肺組織病理學改變,部分肺組織使用免疫組化、Western Blot及RT-PCR檢測GRα及GRβ的表達。統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。以均數(shù)±標準差(sx?)描述數(shù)據(jù),兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用采用單因素方差分析,相關性分析采用Pearson相關。顯著性檢驗水準α=0.05。結果1各組大鼠肺組織病理學改變與空白組相比,COPD組大鼠氣管及支氣管粘膜上皮細胞脫落,炎性細胞浸潤,支氣管平滑肌增厚,膠原沉積,肺泡壁變薄,甚至破裂融合成肺大泡。與COPD患者的氣管及肺組織病理學變化一致。各藥物干預組的大鼠肺組織破壞程度都較COPD組輕,其中聯(lián)合干預組大鼠肺組織破壞最輕。2各組大鼠肺功能改變COPD組大鼠,0.3秒最大呼氣量/用力肺活量(forced expiratory volume0.3/forced vital capacity,FEV0.3/FVC)明顯低于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);吸氣阻力(inspiratory resistance,Ri)、呼氣阻力(expiratory resistance,Re)明顯高于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。克拉霉素組、布地奈德組FEV0.3/FVC均高于COPD組,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);克拉霉素組、布地奈德組Ri及Re明顯低于COPD組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。聯(lián)合干預組FEV0.3/FVC高于COPD組、克拉霉素組及布地奈德組,差異具有統(tǒng)計學意義,聯(lián)合干預組Ri、Re低于COPD組、克拉霉素組及布地奈德組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平COPD組血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯高于空白組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);COPD組肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯高于空白組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。布地奈德組及克拉霉素組血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);布地奈德組及克拉霉素組肺泡灌洗液明顯低于COPD,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。聯(lián)合干預組血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),聯(lián)合干預組肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4肺組織中GRα、GRβ的免疫組化COPD組GRα表達為明顯低于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ表達明顯高于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。布地奈德組、克拉霉素組GRα表達均高于COPD組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ表達均低于COPD組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。聯(lián)合干預組GRα表達高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ表達低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5肺組織中GRα、GRβ蛋白表達水平COPD組GRα蛋白表達水明顯低于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ蛋白表達水平明顯高于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。布地奈德組、克拉霉素組GRα蛋白表達水平均高于COPD組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ蛋白表達水平均低于COPD組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。聯(lián)合干預組GRα蛋白表達水平高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ蛋白表達水平低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6肺組織中GRα、GRβ的m RNA水平COPD組GRαmRNA水平明顯低于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβm RNA水平明顯高于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。布地奈德組、克拉霉素組GRαm RNA水平均高于COPD組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ表達均低于COPD組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。聯(lián)合干預組GRαm RNA水平高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);GRβ表達低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7血清(B)及肺泡灌洗液中(F)INF-γ、IL-32與TNF-α、NF-kb、FEV0.3/FVC、GRα、GRβ相關性分析大鼠血清及肺泡灌洗液中INF-γ與IL-32均呈正相關(P0.05);大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-32與TNF-α、NF-?b均呈正相關(P0.05),與FEV0.3/FVC呈負相關(P0.05)。大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-32、TNF-α、NF-?b與肺組織中GRα免疫組化、蛋白表達水平、m RNA水平均呈負相關(P0.05),與GRβ免疫組化、蛋白表達水平、m RNA均呈正相關(P0.05)。結論1.INF-γ——IL-32——IL-1β正反饋環(huán)參與了COPD的發(fā)病過程,克拉霉素、布地奈德單用或聯(lián)合應用均能不同程度抑制該反饋環(huán)激活,減輕COPD大鼠肺部及全身的炎癥反應,改善COPD大鼠肺功能。2.COPD大鼠GRα表達明顯降低,GRβ表達明顯升高,GRα/GRβ失衡導致COPD大鼠產生糖皮質激素抵抗。3.克拉霉素、布地奈德均在不同程度上調節(jié)GRα/GRβ失衡,逆轉COPD大鼠糖皮質激素抵抗,兩者聯(lián)合應用時效果更明顯,這一過程于INF-γ——IL-32——IL-1β正反饋環(huán)有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563.9

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