發(fā)布時間：2018-11-02 20:13

【摘要】：研究背景 急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見急危重癥，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床缺乏有效治療手段，病死率高。盡管已明確炎性介質(zhì)作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）是導(dǎo)致ARDS的重要原因，但研究表明，單純通過阻斷或封閉炎性介質(zhì)難以取得理想效果。近些年來，研究的熱點逐步轉(zhuǎn)向那些能夠?qū)⒍喾N信號通路聯(lián)系在一起，并對它們進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)身上，如小窩蛋白-1，試圖由此開辟一條ARDS發(fā)病機(jī)制研究的新方向。 小窩(Caveolae)又稱膜內(nèi)陷囊泡，是細(xì)胞膜表面特異性的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，廣泛分布于機(jī)體內(nèi)，參與細(xì)胞分化、增殖、炎癥、腫瘤、衰老等多種病理生理過程。Caveolae在調(diào)控微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性方面的研究并不多見并且各項研究的結(jié)果尚存在很大的爭論：部分研究報道小窩蛋白-1（caveolin-1,Cav-1）的敲除增加血管內(nèi)皮的通透性，另一部分研究認(rèn)為敲除Caveolin-1會導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性的降低。因此，小窩在肺微血管內(nèi)皮通透性中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。 炎癥介質(zhì)如：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）,內(nèi)毒素（LPS）和凝血酶等，引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，主要是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙的形成。而其機(jī)制包括：誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞收縮以及破壞細(xì)胞間的連接。而細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu)和細(xì)胞間的連接受到多種信號通路的調(diào)節(jié)。小G蛋白家族由于能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附和細(xì)胞骨架的動力，很早被認(rèn)為在調(diào)控內(nèi)皮屏障功能中居于重要的地位，尤其是Rac1可以通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin的重構(gòu)，加強(qiáng)細(xì)胞間的連接，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。 皮質(zhì)肌動蛋白結(jié)合蛋白（cortactin）是廣泛存在的酪氨酸激酶的靶點，是Rac1信號通路的主要效應(yīng)蛋白之一，牽涉到皮層肌動蛋白的組裝和重構(gòu)。目前確定，在內(nèi)皮功能加強(qiáng)的情況下，cortactin在細(xì)胞邊界處聚集,導(dǎo)致皮層肌動蛋白分布增加，功能增強(qiáng)，而這一過程依賴于Rac1的激活。在Cortactin基因敲除的內(nèi)皮細(xì)胞，那些能夠穩(wěn)定內(nèi)皮屏障功能的藥物如cAMP、PGE2和PGI2等并不能夠降低炎癥因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性增高。 綜上所述， Rac1-cortactin信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性調(diào)控中具有重要作用，而caveolin-1對血管內(nèi)皮通透性的影響是否與該通路有關(guān)，目前尚未見報道。 目的 構(gòu)建caveolin-1基因RNA干擾慢病毒，觀察抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-ɑ誘導(dǎo)的RPMVECs通透性變化的影響，探討其作用機(jī)制，豐富ARDS的基礎(chǔ)理論，并為臨床防治ARDS提供新的思路。 方法 1. pLL3.7-caveolin-1shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建：確定編碼caveolin-1-shRNA的DNA序列，將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pLL3.7上并進(jìn)行慢病毒包裝、分離以及滴度的測定。 2. RPMVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用體外肺組織塊貼壁法行原代RPMVECs分離、培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，RPMVECs形態(tài)學(xué)特征，并采用植物凝集素結(jié)合試驗進(jìn)行鑒定。 3.慢病毒（含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA）感染RPMVECs及鑒定：慢病毒（含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA）感染RPMVECs，感染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，采用稀釋計數(shù)法測定病毒滴度，用Western-blotting法鑒定轉(zhuǎn)染RPMVECs中目的蛋白表達(dá)情況，確定caveolin-1表達(dá)抑制的效率。 4.抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機(jī)制 RPMVECs分為正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞。按照如下實驗方案分組：正常細(xì)胞未刺激組，正常細(xì)胞TNF-α刺激組，正常細(xì)胞O-Me-cAMP刺激組，正常細(xì)胞O-Me-cAMP+TNF-α共刺激組，陰性沉默對照組（control shRNA），陰性沉默（control shRNA）細(xì)胞TNF-α刺激組，Caveolin-1基因沉默組（Caveolin-1shRNA），Caveolin-1基因沉默細(xì)胞+TNF-α刺激組，Caveolin-1基因沉默細(xì)胞+NSC23766+TNF-α刺激組。 1)抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響：采用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（transendothelial electrical resistance, TER）、異硫氰酸熒光素標(biāo)記白蛋白法觀察細(xì)胞單層通透性變化。 2)抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起肺微血管內(nèi)皮骨架蛋白重構(gòu)的影響：免疫熒光染色激光共聚焦觀察F-actin和cortactin分布變化；western-blot半定量分析cortactin在胞漿和胞膜量的變化。 3)抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起肺微血管內(nèi)皮單層通透性變化、內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)產(chǎn)生影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制： Pull-down及western-blot半定量分析Rac1活性。 結(jié)果 1.經(jīng)酶切和測序證實，成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLL3.7-caveolin-1shRNA，病毒包裝后經(jīng)濃縮得到的病毒懸液滴度為2×108TU/ml。 2.獲得原代培養(yǎng)的RPMVECs，經(jīng)光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和植物凝集素結(jié)合試驗加以鑒定。 3.慢病毒感染RPMVECs后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。Westernblotting法可檢測到相應(yīng)目的蛋白表達(dá)，24h后即出現(xiàn)caveolin-1的表達(dá)抑制，48h抑制caveolin-1的表達(dá)至陰性沉默對照組caveolin-1表達(dá)水平的60±10%；72h抑制達(dá)最小值約為陰性沉默對照組的10±2%。而陰性沉默對照組caveolin-1表達(dá)水平在0、24、48、72h變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機(jī)制 1)抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響：100ng/ml TNF-α刺激RPMVECs單層時，TER呈時間依賴性下降；在刺激2小時，TER下降最顯著，，降到基礎(chǔ)值的63±5%；FITC-BSA的通透率升高最顯著，達(dá)到基礎(chǔ)值的205±23%；200M O-Me-cAMP能抑制TNF-α誘導(dǎo)的TER的下降和FITC-BSA通透率的增加。抑制caveolin-1表達(dá)，靜息狀態(tài)下TER較control shRNA組升高到116±10%， FITC-BSA的通透率較controlshRNA組略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。當(dāng)caveolin-1shRNA組和control shRNA組細(xì)胞單層受TNF-α刺激2h，caveolin-1shRNA組TER的值降到刺激前的78±7%，control shRNA組TER的值降到刺激前的59±4%，可見caveolin-1shRNA組TER值下降程度較control shRNA組為少，兩組間比較(78±7%vs59±4%)差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；觀察FITC-BSA通透率方面變化可見：control shRNA組在受到TNF-α刺激2h后，F(xiàn)ITC-BSA的通透率明顯增加到刺激前的197±27%， caveolin-1-shRNA組通透率升高到刺激前的122±11%，兩組間比較有顯著性差異（197±27%vs122±11%, p＜0.05）。敲除caveolin-1可以抵御TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性的增加。Rac1的抑制劑-NSC23766能取消敲除caveolin-1帶來的內(nèi)皮屏障保護(hù)效應(yīng)。 2)抑制caveolin-1表達(dá)對PMVECsF-actin和cortactin分布的影響：TNF-α刺激control-shRNA細(xì)胞2小時可見： F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整、排列紊亂，細(xì)胞邊界已不可辨, F-actin重組，從細(xì)胞周邊向細(xì)胞中心轉(zhuǎn)移并成平行束狀堆積、增厚，細(xì)胞中央應(yīng)力纖維形成，而胞漿中分布的cortactin變得紊亂，皮質(zhì)區(qū)和細(xì)胞膜上的分布也變得很不明顯；細(xì)胞邊界模糊，形態(tài)不清，而western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯減少。caveolin-1-shRNA組： F-actin重組明顯，從細(xì)胞中央向細(xì)胞周邊轉(zhuǎn)移并形成皮質(zhì)區(qū)F-actin增厚強(qiáng)化，細(xì)胞中央束狀應(yīng)力纖維形成明顯減少，細(xì)胞偽足形成明顯。而胞漿中分布的cortactin明顯向膜上轉(zhuǎn)位，在細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)分布明顯，并在細(xì)胞膜上成線樣強(qiáng)化分布；western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯增加。給予TNF-α刺激2h，皮質(zhì)區(qū)F-actin分布強(qiáng)化依舊明顯，胞漿區(qū)F-actin分布比較紊亂，但細(xì)胞中央的束狀應(yīng)力纖維比較明顯，細(xì)胞偽足形成仍可見到；細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)和偽足區(qū)cortactin分布減少不明顯，胞漿區(qū)cortactin分布也沒有明顯減少，western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量較TNF-α刺激前減少不明顯，但是較control-shRNA+TNF-α組明顯增加。 3)抑制caveolin-1表達(dá)對Rac1信號通路活性的影響：抑制caveolin-1表達(dá)可以增加RPMVEC內(nèi)Rac1的活性，抑制TNF-α導(dǎo)致的RPMVEC內(nèi)Rac1活性的降低：在靜息情況下shRNA方法沉默caveolin-1基因表達(dá)可以明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞中Rac1酶的活性，較陰性沉默對照組（controlshRNA）升高2.5±0.2倍（n=6，P＜0.01）；而在TNF-α刺激2h后，caveolin-1-shRNA組Rac1酶的活性是control shRNA組酶活性的2.7±0.4倍（n=6， P＜0.01）。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建caveolin-1基因表達(dá)抑制的RPMVECs單層模型。 2.抑制caveolin-1表達(dá)，可以減輕TNF-α所致RPMVECs單層通透性的增加。 3. TNF-α引起Rac1活性的降低，可能是其導(dǎo)致RPMVECs通透性增高的機(jī)制之一。抑制caveolin-1表達(dá)可以上調(diào)Rac1的活性導(dǎo)致皮質(zhì)區(qū)cortactin和F-actin骨架蛋白分布的增加，加強(qiáng)細(xì)胞間連接，從而加強(qiáng)內(nèi)皮的屏障功能，抵御TNF-α誘導(dǎo)的RPMVECs單層通透性的增加. 4.在TNF-α刺激下，特異性阻斷Rac1的活性，可削弱caveolin-1表達(dá)抑制帶來的內(nèi)皮屏障保護(hù)效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.8

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 何芳;尹飛;彭鏡;鄧小鹿;吳麗文;張慈柳;;LPS誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的分子機(jī)制(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年11期

2 岳揚(yáng);孫耕耘;尤青海;王楠;邵敏;張丹;;靶向大鼠Caveolin-1基因的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建[J];臨床肺科雜志;2012年05期

3 張也頻;章宗籍;;Cip/Kip家族的獨(dú)特成員——p57Kip2的研究進(jìn)展[J];中國腫瘤生物治療雜志;2011年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 卜強(qiáng);RhoC和ROCK-1在前列腺癌中的表達(dá)及其對MAPK和Akt影響的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 盧瑗瑗;結(jié)直腸癌相關(guān)抗原MC3-Ag的鑒定和功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 孫玉;Caveolin-1在氧化應(yīng)激致肺血管通透性增加中的作用和調(diào)控機(jī)制[D];山東大學(xué);2010年

4 周聞白;促微管聚合蛋白3（TPPP3）及Prokineticin2（PK2）蛋白功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

5 黃一波;Math1誘導(dǎo)的前庭毛細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)分化過程與細(xì)胞增殖[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

6 韓文軍;蛋白磷酸酶2A催化亞基PP-2Aca過表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)及其功能研究[D];湖南師范大學(xué);2009年

7 仇劍波;禾谷鐮孢菌β-微管蛋白基因定點突變及敲除對多菌靈敏感性和基因表達(dá)譜的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 張飛;mTORC2/Rictor調(diào)控非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 張也頻;人肝癌miR-221、miR-222和miR-92b與p57kip2表達(dá)關(guān)系的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

2 陳茜;HAMSC分化過程的生物力學(xué)特性及納米金對血管生成抑制作用的研究[D];暨南大學(xué);2011年

3 王茜;窖蛋白-1在波動性高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

4 蔡小芳;青蒿琥酯的細(xì)胞膜毒性及健康人淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞形態(tài)和力學(xué)的研究[D];暨南大學(xué);2010年

5 程健;Gelsolin在結(jié)直腸癌組織和血漿中的表達(dá)及其臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2306834