【摘要】：肥胖和哮喘已成為世界范圍內(nèi)兩大重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,流行病學(xué)資料顯示兩者間存在關(guān)聯(lián),肥胖時(shí)哮喘的發(fā)病率和嚴(yán)重程度增加,臨床治療難度加大,表明肥胖是哮喘的危險(xiǎn)因素。肥胖時(shí)機(jī)體處于系統(tǒng)性炎癥狀態(tài),哮喘病理本質(zhì)上也是一種氣道慢性炎癥,存在免疫的異常激活和免疫失衡,據(jù)此我們推測(cè),肥胖為哮喘的發(fā)生提供了適合的免疫炎癥基礎(chǔ),從而增加哮喘的易感性。脂肪細(xì)胞因子(adipokines)是脂肪組織來(lái)源的一類特殊分泌蛋白,在肥胖時(shí)表達(dá)異常,參與多種肥胖相關(guān)疾病如2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,被認(rèn)為是能量代謝與免疫炎癥雙通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子。深入探討它們?cè)诜逝窒械淖饔每赡転閮烧呦嚓P(guān)提供新的理論依據(jù),為哮喘防治打開(kāi)新思路。氣道上皮細(xì)胞處于哮喘發(fā)病過(guò)程的起始環(huán)節(jié),不僅作為機(jī)械屏障抵御外界有害刺激,還具有分泌細(xì)胞因子、抗原呈遞等多種生物學(xué)功能。它在局部與T細(xì)胞交互作用,共同構(gòu)筑了氣道黏膜免疫系統(tǒng),維持微環(huán)境的平衡和穩(wěn)定。我們據(jù)此假設(shè)：脂肪細(xì)胞因子可能通過(guò)調(diào)節(jié)氣道上皮免疫信號(hào)的傳遞而影響局部黏膜免疫狀態(tài),介導(dǎo)肥胖與哮喘相關(guān)。 目的： 為驗(yàn)證以上假設(shè),本文擬①建立肥胖哮喘模型,觀察三種脂肪細(xì)胞因子瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)和抵抗素(resistin)在肥胖哮喘時(shí)的表達(dá)水平,并分析它們與氣道反應(yīng)性、氣道炎癥的關(guān)系；②觀察這三種脂肪細(xì)胞因子對(duì)支氣管上皮細(xì)胞增殖、損傷修復(fù)和氧化性凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)并分析可能機(jī)制；③觀察這三種脂肪細(xì)胞因子在氣道免疫炎癥信號(hào)傳遞中的作用,評(píng)價(jià)它們?cè)跉獾鲤つっ庖咧械牡匚弧?方法與結(jié)果： 1.脂肪細(xì)胞因子對(duì)肥胖哮喘小鼠模型氣道炎癥的影響 (1)小鼠肥胖哮喘模型的建立和氣道炎癥鑒定：高脂飲食和OVA致敏激發(fā)建立C57BL/6J小鼠肥胖哮喘模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組,單純肥胖組、單純哮喘組和肥胖哮喘組。稱量體重、計(jì)算Lee's指數(shù)、肝臟油紅O染色確定肥胖程度,Buxco系統(tǒng)檢測(cè)肺功能,肺臟病理切片HE染色觀察肺部炎癥病理改變,并行支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎細(xì)胞計(jì)數(shù)分類以確立模型成功。結(jié)果顯示,高脂飲食更易導(dǎo)致雌性小鼠肥胖,肥胖哮喘小鼠氣道反應(yīng)顯著增高；肺部炎癥性病理改變更加明顯,BALF中蛋白和炎細(xì)胞大量滲出,相比單純哮喘組炎癥程度加重。 (2)脂肪細(xì)胞因子、Th細(xì)胞因子血清和BALF含量測(cè)定和相關(guān)分析：ELISA法檢測(cè)血漿與BALF中瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素的含量,行Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)它們的BALF水平和血漿水平的關(guān)系。結(jié)果顯示,肥胖時(shí)瘦素在血漿和BALF中均增高,且兩者呈正相關(guān)(R2=0.5669,P0.05)。對(duì)BALF中瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素與氣道阻力、免疫炎癥因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,肥胖促進(jìn)肺部炎癥向Thl型偏移,BALF中脂聯(lián)素含量與氣道阻力負(fù)相關(guān)(R2=0.987,P0.05),與IFN-γ水平也呈負(fù)相關(guān)(R2=0.9146,P0.05),可能在氣道具有抗炎保護(hù)效應(yīng)。 2.脂肪細(xì)胞因子對(duì)HBECs增殖、損傷修復(fù)和凋亡的影響 (1)脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素影響支氣管上皮細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)：以瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素預(yù)處理細(xì)胞,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期,并24小時(shí)視頻系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察HBECs機(jī)械性缺損修復(fù)過(guò)程。結(jié)果顯示,脂聯(lián)素可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,加速細(xì)胞周期(脂聯(lián)素處理組G1期細(xì)胞減少了約10%,而S+G2期細(xì)胞從32.29%±1.78%增加到43.19%±3.81%,P0.05),并加速損傷修復(fù)過(guò)程。應(yīng)用鈣離子熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,鈣調(diào)素抑制劑預(yù)處理可阻斷脂聯(lián)素的促修復(fù)效應(yīng),表明鈣離子/鈣調(diào)素途徑介導(dǎo)了脂聯(lián)素對(duì)氣道上皮細(xì)胞增殖、修復(fù)功能的調(diào)控。 (2)脂肪細(xì)胞因子對(duì)支氣管上皮細(xì)胞氧化性凋亡的作用及機(jī)制分析：以Annexin V/PI雙染試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)臭氧應(yīng)激引起的支氣管上皮細(xì)胞凋亡,觀察脂肪細(xì)胞因子預(yù)處理對(duì)氧化性凋亡的作用。結(jié)果顯示,脂聯(lián)素可以顯著減少臭氧誘導(dǎo)的HBEC細(xì)胞凋亡,使臭氧應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡從58.76%±3.06%降低至3.76%±1.31%,將細(xì)胞存活率從28.66%土2.42%提高至82.98%±3.96%,P0.05。利用活性氧探針標(biāo)記支氣管上皮細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素預(yù)處理的細(xì)胞ROS水平下降。PCR結(jié)果表明支氣管上皮細(xì)胞脂聯(lián)素受體adipoR1呈優(yōu)勢(shì)表達(dá),流式結(jié)果證實(shí)脂聯(lián)素可逆轉(zhuǎn)臭氧誘導(dǎo)的adipoR1減少,表明脂聯(lián)素可能通過(guò)與其受體adipoRl之間的反饋調(diào)節(jié)作用影響支氣管上皮細(xì)胞的氧化性凋亡。 3.脂肪細(xì)胞因子對(duì)支氣管上皮細(xì)胞免疫信號(hào)傳遞的影響 (1)脂肪細(xì)胞因子對(duì)共培養(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖的作用：以CFSE熒光探針標(biāo)記淋巴細(xì)胞,并與支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng),觀察脂肪細(xì)胞因子預(yù)處理對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。CFSE熒光隨增殖淋巴細(xì)胞傳代而衰減,可反映淋巴細(xì)胞的不同增殖代數(shù)。流式結(jié)果表明,三種脂肪細(xì)胞因子作用于單獨(dú)的或正常共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞不能影響其增殖,但在非變應(yīng)性因素LPS刺激時(shí),瘦素可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。而脂聯(lián)素則對(duì)增殖起抑制作用,使第一代淋巴細(xì)胞比例從LPS刺激時(shí)的17.47%±2.99%增高到26.04%±3.80%,P0.05。而在變應(yīng)性O(shè)VA刺激時(shí),未見(jiàn)三種脂肪細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有顯著影響(P0.05)。 (2)脂肪細(xì)胞因子對(duì)共培養(yǎng)淋巴細(xì)胞CD4/CD8亞群分化比例的調(diào)節(jié)：以CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-Cy5三標(biāo)抗體檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD4、CD8亞群比例。流式結(jié)果顯示,與支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的懸浮淋巴細(xì)胞CD4比例相對(duì)下調(diào),脂肪細(xì)胞因子對(duì)CD4、CD8各亞群比例和CD4/CD8比值沒(méi)有影響(P0.05)。 (3)脂肪細(xì)胞因子對(duì)共培養(yǎng)淋巴細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞粘附的作用：以CD3-FITC抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞,光鏡和熒光顯微鏡下觀察其與支氣管上皮細(xì)胞間的粘附,并以酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粘附率。結(jié)果顯示,淋巴細(xì)胞可與支氣管上皮細(xì)胞特異性粘附,似乎對(duì)CD4細(xì)胞更具選擇性。瘦素在LPS和OVA刺激時(shí)對(duì)兩者粘附的作用似乎呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脂聯(lián)素和抵抗素也不影響兩種細(xì)胞間的粘附率(P0.05)。 (4)脂肪細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞Th細(xì)胞因子分泌的影響：ELISA法檢測(cè)脂肪細(xì)胞因子對(duì)共培養(yǎng)淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IFN-y和IL-17的影響。結(jié)果顯示,在LPS刺激時(shí),瘦素或抵抗素對(duì)共培養(yǎng)上清液中的IFN-Υ和IL-17的表達(dá)起促進(jìn)作用；脂聯(lián)素可減少IFN-y的產(chǎn)生,但也增加了IL-17生成。在OVA刺激時(shí),瘦素促進(jìn)共培養(yǎng)上清液中IFN-Υ、IL-17的分泌,抵抗素降低IFN-Υ的生成,但增加了IL-17的分泌水平。脂聯(lián)素可降低IFN-Υ的表達(dá)水平、對(duì)IL-17的分泌沒(méi)有影響。三種脂肪細(xì)胞因子均對(duì)IL-4的分泌沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。 (5)脂肪細(xì)胞因子對(duì)HBECs攝取OVA和表達(dá)TLR4蛋白的影響：熒光顯微鏡下觀察FITC-OVA的攝取,流式細(xì)胞術(shù)定量分析。結(jié)果顯示,三種因子不影響HBECs對(duì)OVA的攝取。流式細(xì)胞結(jié)果也表明,LPS刺激HBEC可誘導(dǎo)TLR4表達(dá)上調(diào)(平均熒光強(qiáng)度26.54±3.62),而加入脂聯(lián)素后TLR4的表達(dá)有下降趨勢(shì)(平均熒光強(qiáng)度19.9±1.97),P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (6)脂肪細(xì)胞因子對(duì)HBECs中B7分子表達(dá)譜的影響：FLeal-timePCR結(jié)果顯示,adipokines預(yù)處理后HBECs中B7家族各分子表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變,但脂聯(lián)素作用下表現(xiàn)出CD80/D86匕值相對(duì)降低、PD-L1/PD-L2比值相對(duì)升高的趨勢(shì)(P0.05),也許介導(dǎo)了脂聯(lián)素的免疫調(diào)節(jié)功能。 (7)脂肪細(xì)胞因子對(duì)支氣管上皮細(xì)胞TSLP分泌的影響：ELISA結(jié)果表明,OVA可刺激支氣管上皮細(xì)胞TSLP的分泌。在不論刺激物為L(zhǎng)PS或是OVA,三種脂肪細(xì)胞因子對(duì)TSLP的分泌均無(wú)顯著影響(P0.05)。提示TSLP以外的信號(hào)途徑介導(dǎo)脂肪細(xì)胞因子對(duì)HBECs免疫功能的間接調(diào)節(jié)。 結(jié)論： 1.肥胖可加重哮喘氣道反應(yīng)性和局部炎癥,支氣管肺泡灌洗液中的脂聯(lián)素與氣道阻力、Thl型炎癥密切相關(guān),在氣道局部可能具有抗炎效應(yīng)。 2.脂聯(lián)素可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞增殖,加速機(jī)械性損傷后修復(fù)過(guò)程,抵抗氧化損傷和凋亡,具有氣道保護(hù)作用。 3.脂肪細(xì)胞因子作用于支氣管上皮細(xì)胞免疫信號(hào)傳遞的不同方面,與淋巴細(xì)胞交互作用,參與氣道黏膜免疫調(diào)控。 全文共有圖40幅,表10個(gè),參考文獻(xiàn)216篇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R562.25;R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2283963