【摘要】：肥胖和哮喘已成為世界范圍內(nèi)兩大重要的公共衛(wèi)生問題,流行病學(xué)資料顯示兩者間存在關(guān)聯(lián),肥胖時哮喘的發(fā)病率和嚴重程度增加,臨床治療難度加大,表明肥胖是哮喘的危險因素。肥胖時機體處于系統(tǒng)性炎癥狀態(tài),哮喘病理本質(zhì)上也是一種氣道慢性炎癥,存在免疫的異常激活和免疫失衡,據(jù)此我們推測,肥胖為哮喘的發(fā)生提供了適合的免疫炎癥基礎(chǔ),從而增加哮喘的易感性。脂肪細胞因子(adipokines)是脂肪組織來源的一類特殊分泌蛋白,在肥胖時表達異常,參與多種肥胖相關(guān)疾病如2型糖尿病、動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,被認為是能量代謝與免疫炎癥雙通路的關(guān)鍵節(jié)點分子。深入探討它們在肥胖哮喘中的作用可能為兩者相關(guān)提供新的理論依據(jù),為哮喘防治打開新思路。氣道上皮細胞處于哮喘發(fā)病過程的起始環(huán)節(jié),不僅作為機械屏障抵御外界有害刺激,還具有分泌細胞因子、抗原呈遞等多種生物學(xué)功能。它在局部與T細胞交互作用,共同構(gòu)筑了氣道黏膜免疫系統(tǒng),維持微環(huán)境的平衡和穩(wěn)定。我們據(jù)此假設(shè)：脂肪細胞因子可能通過調(diào)節(jié)氣道上皮免疫信號的傳遞而影響局部黏膜免疫狀態(tài),介導(dǎo)肥胖與哮喘相關(guān)。 目的： 為驗證以上假設(shè),本文擬①建立肥胖哮喘模型,觀察三種脂肪細胞因子瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)和抵抗素(resistin)在肥胖哮喘時的表達水平,并分析它們與氣道反應(yīng)性、氣道炎癥的關(guān)系；②觀察這三種脂肪細胞因子對支氣管上皮細胞增殖、損傷修復(fù)和氧化性凋亡過程的調(diào)節(jié)并分析可能機制；③觀察這三種脂肪細胞因子在氣道免疫炎癥信號傳遞中的作用,評價它們在氣道黏膜免疫中的地位。 方法與結(jié)果： 1.脂肪細胞因子對肥胖哮喘小鼠模型氣道炎癥的影響 (1)小鼠肥胖哮喘模型的建立和氣道炎癥鑒定：高脂飲食和OVA致敏激發(fā)建立C57BL/6J小鼠肥胖哮喘模型。實驗分為正常對照組,單純肥胖組、單純哮喘組和肥胖哮喘組。稱量體重、計算Lee's指數(shù)、肝臟油紅O染色確定肥胖程度,Buxco系統(tǒng)檢測肺功能,肺臟病理切片HE染色觀察肺部炎癥病理改變,并行支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎細胞計數(shù)分類以確立模型成功。結(jié)果顯示,高脂飲食更易導(dǎo)致雌性小鼠肥胖,肥胖哮喘小鼠氣道反應(yīng)顯著增高；肺部炎癥性病理改變更加明顯,BALF中蛋白和炎細胞大量滲出,相比單純哮喘組炎癥程度加重。 (2)脂肪細胞因子、Th細胞因子血清和BALF含量測定和相關(guān)分析：ELISA法檢測血漿與BALF中瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素的含量,行Pearson相關(guān)分析評價它們的BALF水平和血漿水平的關(guān)系。結(jié)果顯示,肥胖時瘦素在血漿和BALF中均增高,且兩者呈正相關(guān)(R2=0.5669,P0.05)。對BALF中瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素與氣道阻力、免疫炎癥因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平之間的相關(guān)性進行分析,結(jié)果表明,肥胖促進肺部炎癥向Thl型偏移,BALF中脂聯(lián)素含量與氣道阻力負相關(guān)(R2=0.987,P0.05),與IFN-γ水平也呈負相關(guān)(R2=0.9146,P0.05),可能在氣道具有抗炎保護效應(yīng)。 2.脂肪細胞因子對HBECs增殖、損傷修復(fù)和凋亡的影響 (1)脂肪細胞因子脂聯(lián)素影響支氣管上皮細胞增殖和損傷修復(fù)：以瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素預(yù)處理細胞,MTT法檢測細胞增殖活力,流式細胞術(shù)分析細胞周期,并24小時視頻系統(tǒng)動態(tài)觀察HBECs機械性缺損修復(fù)過程。結(jié)果顯示,脂聯(lián)素可顯著促進細胞增殖,加速細胞周期(脂聯(lián)素處理組G1期細胞減少了約10%,而S+G2期細胞從32.29%±1.78%增加到43.19%±3.81%,P0.05),并加速損傷修復(fù)過程。應(yīng)用鈣離子熒光探針對細胞進行標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以增加細胞內(nèi)鈣離子濃度,鈣調(diào)素抑制劑預(yù)處理可阻斷脂聯(lián)素的促修復(fù)效應(yīng),表明鈣離子/鈣調(diào)素途徑介導(dǎo)了脂聯(lián)素對氣道上皮細胞增殖、修復(fù)功能的調(diào)控。 (2)脂肪細胞因子對支氣管上皮細胞氧化性凋亡的作用及機制分析：以Annexin V/PI雙染試劑盒在流式細胞儀上檢測臭氧應(yīng)激引起的支氣管上皮細胞凋亡,觀察脂肪細胞因子預(yù)處理對氧化性凋亡的作用。結(jié)果顯示,脂聯(lián)素可以顯著減少臭氧誘導(dǎo)的HBEC細胞凋亡,使臭氧應(yīng)激引起的細胞凋亡從58.76%±3.06%降低至3.76%±1.31%,將細胞存活率從28.66%土2.42%提高至82.98%±3.96%,P0.05。利用活性氧探針標(biāo)記支氣管上皮細胞檢測發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素預(yù)處理的細胞ROS水平下降。PCR結(jié)果表明支氣管上皮細胞脂聯(lián)素受體adipoR1呈優(yōu)勢表達,流式結(jié)果證實脂聯(lián)素可逆轉(zhuǎn)臭氧誘導(dǎo)的adipoR1減少,表明脂聯(lián)素可能通過與其受體adipoRl之間的反饋調(diào)節(jié)作用影響支氣管上皮細胞的氧化性凋亡。 3.脂肪細胞因子對支氣管上皮細胞免疫信號傳遞的影響 (1)脂肪細胞因子對共培養(yǎng)淋巴細胞增殖的作用：以CFSE熒光探針標(biāo)記淋巴細胞,并與支氣管上皮細胞共培養(yǎng),觀察脂肪細胞因子預(yù)處理對淋巴細胞增殖的影響。CFSE熒光隨增殖淋巴細胞傳代而衰減,可反映淋巴細胞的不同增殖代數(shù)。流式結(jié)果表明,三種脂肪細胞因子作用于單獨的或正常共培養(yǎng)的淋巴細胞不能影響其增殖,但在非變應(yīng)性因素LPS刺激時,瘦素可促進淋巴細胞增殖。而脂聯(lián)素則對增殖起抑制作用,使第一代淋巴細胞比例從LPS刺激時的17.47%±2.99%增高到26.04%±3.80%,P0.05。而在變應(yīng)性O(shè)VA刺激時,未見三種脂肪細胞因子對淋巴細胞增殖有顯著影響(P0.05)。 (2)脂肪細胞因子對共培養(yǎng)淋巴細胞CD4/CD8亞群分化比例的調(diào)節(jié)：以CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-Cy5三標(biāo)抗體檢測淋巴細胞CD4、CD8亞群比例。流式結(jié)果顯示,與支氣管上皮細胞共培養(yǎng)的懸浮淋巴細胞CD4比例相對下調(diào),脂肪細胞因子對CD4、CD8各亞群比例和CD4/CD8比值沒有影響(P0.05)。 (3)脂肪細胞因子對共培養(yǎng)淋巴細胞與支氣管上皮細胞粘附的作用：以CD3-FITC抗體標(biāo)記T淋巴細胞,光鏡和熒光顯微鏡下觀察其與支氣管上皮細胞間的粘附,并以酶標(biāo)儀和流式細胞術(shù)檢測粘附率。結(jié)果顯示,淋巴細胞可與支氣管上皮細胞特異性粘附,似乎對CD4細胞更具選擇性。瘦素在LPS和OVA刺激時對兩者粘附的作用似乎呈現(xiàn)出相反的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異。脂聯(lián)素和抵抗素也不影響兩種細胞間的粘附率(P0.05)。 (4)脂肪細胞因子對淋巴細胞Th細胞因子分泌的影響：ELISA法檢測脂肪細胞因子對共培養(yǎng)淋巴細胞分泌IL-4、IFN-y和IL-17的影響。結(jié)果顯示,在LPS刺激時,瘦素或抵抗素對共培養(yǎng)上清液中的IFN-Υ和IL-17的表達起促進作用；脂聯(lián)素可減少IFN-y的產(chǎn)生,但也增加了IL-17生成。在OVA刺激時,瘦素促進共培養(yǎng)上清液中IFN-Υ、IL-17的分泌,抵抗素降低IFN-Υ的生成,但增加了IL-17的分泌水平。脂聯(lián)素可降低IFN-Υ的表達水平、對IL-17的分泌沒有影響。三種脂肪細胞因子均對IL-4的分泌沒有調(diào)節(jié)作用。 (5)脂肪細胞因子對HBECs攝取OVA和表達TLR4蛋白的影響：熒光顯微鏡下觀察FITC-OVA的攝取,流式細胞術(shù)定量分析。結(jié)果顯示,三種因子不影響HBECs對OVA的攝取。流式細胞結(jié)果也表明,LPS刺激HBEC可誘導(dǎo)TLR4表達上調(diào)(平均熒光強度26.54±3.62),而加入脂聯(lián)素后TLR4的表達有下降趨勢(平均熒光強度19.9±1.97),P0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。 (6)脂肪細胞因子對HBECs中B7分子表達譜的影響：FLeal-timePCR結(jié)果顯示,adipokines預(yù)處理后HBECs中B7家族各分子表達水平?jīng)]有顯著改變,但脂聯(lián)素作用下表現(xiàn)出CD80/D86匕值相對降低、PD-L1/PD-L2比值相對升高的趨勢(P0.05),也許介導(dǎo)了脂聯(lián)素的免疫調(diào)節(jié)功能。 (7)脂肪細胞因子對支氣管上皮細胞TSLP分泌的影響：ELISA結(jié)果表明,OVA可刺激支氣管上皮細胞TSLP的分泌。在不論刺激物為LPS或是OVA,三種脂肪細胞因子對TSLP的分泌均無顯著影響(P0.05)。提示TSLP以外的信號途徑介導(dǎo)脂肪細胞因子對HBECs免疫功能的間接調(diào)節(jié)。 結(jié)論： 1.肥胖可加重哮喘氣道反應(yīng)性和局部炎癥,支氣管肺泡灌洗液中的脂聯(lián)素與氣道阻力、Thl型炎癥密切相關(guān),在氣道局部可能具有抗炎效應(yīng)。 2.脂聯(lián)素可促進支氣管上皮細胞增殖,加速機械性損傷后修復(fù)過程,抵抗氧化損傷和凋亡,具有氣道保護作用。 3.脂肪細胞因子作用于支氣管上皮細胞免疫信號傳遞的不同方面,與淋巴細胞交互作用,參與氣道黏膜免疫調(diào)控。 全文共有圖40幅,表10個,參考文獻216篇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25;R589.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 夏宇;黃英;袁紅欣;王�？�;婁小麗;;肥胖哮喘動物模型的建立[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年21期

2 趙飛;肥胖對免疫功能的影響[J];國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊);2003年06期

3 王炳芳;Ca~(2+)與肝細胞增殖[J];國外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊);1994年02期

4 孫爾維;袁小澎;羅宇維;陳忠華;;CFSE標(biāo)記的淋巴細胞增殖實驗檢測方法的建立[J];廣東醫(yī)學(xué);2008年10期

5 邱云志;甘露;王紅;楊慶仁;王秀卿;王志玲;;鈣調(diào)素及其對細胞增殖的影響研究現(xiàn)狀[J];華北國防醫(yī)藥;2006年03期

6 畢楠,陳保生;一個新的脂肪因子——脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)與功能的研究進展[J];中國動脈硬化雜志;2005年04期

7 彭麗花;秦曉群;譚宇蓉;向陽;劉惠君;;肺內(nèi)調(diào)節(jié)肽對人支氣管上皮細胞HLA-DR、CD80、CD86表達的影響[J];生理學(xué)報;2008年06期

8 陳凱;韓偉;唐華平;蘇毅;;氧化應(yīng)激反應(yīng)對肥胖型哮喘小鼠氣道炎癥和重建影響[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

9 楊運剛,陳茂榮;T淋巴細胞在兒童支氣管哮喘發(fā)生中的作用[J];實用兒科臨床雜志;2003年08期

10 張建華;;支氣管哮喘的流行病學(xué)及高危因素[J];實用兒科臨床雜志;2008年04期

，

本文編號：2283963