發(fā)布時(shí)間：2018-09-18 07:39

【摘要】：背景： 阻塞性睡眠呼吸暫停（Obstructive sleep apnea, OSA）是臨床常見的睡眠呼吸紊亂性疾病，主要表現(xiàn)為睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)的上氣道完全或部分阻塞所致的呼吸暫停和呼吸淺慢，伴隨乏氧、睡眠覺醒和血流動(dòng)力學(xué)變化，其中，OSA所致的慢性間歇性乏氧（Chronic intermittent hypoxia, CIH）是引起其病理改變的主要成分。OSA是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與心血管疾病的發(fā)病率及死亡率增高直接相關(guān)，因此，OSA已成為減少心血管疾病的公共健康干預(yù)的重要靶點(diǎn)。 雖然OSA與多種心血管疾病密切相關(guān)，但OSA對(duì)心血管系統(tǒng)影響的動(dòng)態(tài)過程及其機(jī)制尚未完全明了，目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是OSA所致心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一，我們推測(cè)：OSA對(duì)心血管系統(tǒng)的影響及其所致氧化應(yīng)激存在時(shí)間依賴效應(yīng)。金屬硫蛋白（Metallothionein, MT）是一種非特異性、內(nèi)源性、強(qiáng)有力的抗氧化劑，在包括心臟在內(nèi)的多個(gè)器官中表達(dá)，我們推測(cè)：MT作為內(nèi)源性抗氧化劑能通過其抗氧化作用保護(hù)OSA所致的心肌損傷。目前有關(guān)心臟對(duì)CIH的動(dòng)態(tài)反應(yīng)及MT在OSA所致心血管疾病中是否具有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。 目的： 本研究應(yīng)用CIH處理的小鼠模型模擬OSA患者的疾病狀態(tài)。首先給予野生型FVB小鼠不同時(shí)間的CIH處理，旨在觀察心臟對(duì)CIH反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以闡明心臟對(duì)CIH的反應(yīng)是否存在時(shí)間依賴效應(yīng)，并闡明CIH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否為其誘導(dǎo)心肌損傷的主要發(fā)病機(jī)制。同時(shí)應(yīng)用抗氧化劑治療，進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用，并應(yīng)用心臟特異性過表達(dá)金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠（Metallothionein-transgene, MT-TG）的CIH模型，觀察MT對(duì)CIH所致心肌損傷是否具有保護(hù)作用，以明確MT作為內(nèi)源性抗氧化劑是否能保護(hù)CIH所致的心肌損傷，從而進(jìn)一步論證氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的機(jī)制，以期為臨床預(yù)防及治療OSA所致心血管疾病提供理論依據(jù)并試圖尋找新的藥物治療靶點(diǎn)。 方法： 本研究共分三部分進(jìn)行：1）應(yīng)用CIH處理的野生型FVB小鼠模型，給予不同時(shí)間的CIH處理，分別從心臟的結(jié)構(gòu)和功能及細(xì)胞和分子水平觀察心臟對(duì)CIH的反應(yīng)是否存在時(shí)間依賴效應(yīng)并進(jìn)行機(jī)制研究；2）應(yīng)用抗氧化劑處理FVB小鼠，并給予CIH處理，擬闡明氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用；3）給予MT-TG鼠及其野生型FVB鼠CIH處理4周及8周，除進(jìn)一步觀察心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng)外，同時(shí)觀察心肌組織MT的過表達(dá)是否對(duì)CIH誘導(dǎo)的心肌損傷有保護(hù)作用，以進(jìn)一步應(yīng)用MT-TG鼠論證氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用。 1心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng) 為觀察心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng)，我們將8-10周雄性野生型FVB鼠暴露于CIH3天、7天（1周）、14天（2周）、21天（3周）、28天（4周）及56天（8周），動(dòng)態(tài)觀察下述指標(biāo)的變化以明確心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng)及其機(jī)制。 （1）體重、心臟重量及心臟重量與脛骨長(zhǎng)度比值：在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量體重、心臟重量、脛骨長(zhǎng)度，并計(jì)算心臟重量與脛骨長(zhǎng)度比值作為心臟的相對(duì)重量，用以觀察CIH是否影響動(dòng)物生長(zhǎng)并誘導(dǎo)心肌肥厚。 （2）心肌肥厚標(biāo)志基因檢測(cè)：應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time polymerasechain reaction, RT-PCR）及免疫印跡技術(shù)（Western-blot）檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志基因：心房利鈉肽（Atrial natriuretic peptide, ANP）及β-肌紅蛋白重鏈（β-myosin heavy chain,β-MHC）的mRNA及ANP的蛋白質(zhì)表達(dá)。 （3）心臟結(jié)構(gòu)及功能檢測(cè)：應(yīng)用超聲心動(dòng)圖在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)及功能。 （4）心肌纖維化檢測(cè)：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)纖維化相關(guān)指標(biāo)：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor, CTGF）及血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）的蛋白質(zhì)表達(dá)，并應(yīng)用天狼星紅染色檢測(cè)心肌組織膠原沉積。 （5）心肌組織炎癥檢測(cè)：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)炎癥相關(guān)指標(biāo)：細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1（Intracellular adhesion molecule-1, ICAM-1）及血管細(xì)胞粘附分子-1（Vascularcell adhesion molecule-1, VCAM-1）的蛋白質(zhì)表達(dá)，并應(yīng)用特異性萘酚A.S-D氯醋酸酯酶染色方法檢測(cè)心肌中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。 （6）心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)：CIEBP同源蛋白（CIEBP homologous protein, CHOP）及裂解的Caspase-3（Cleaved-caspase-3, C-Cas-3）的蛋白表達(dá)，并應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)心肌組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 （7）心肌氧化損傷檢測(cè)：應(yīng)用硫代巴比土酸方法檢測(cè)心肌組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的含量，并應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)心肌組織抗氧化指標(biāo)：MT、銅/鋅過氧化物酶（SOD1）及核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2）的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)心肌組織MT的表達(dá)。 2CIH所致心肌損傷機(jī)制研究 為明確CIH所致心肌損傷的機(jī)制，分別應(yīng)用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)抑制劑Apocynin （3mg/Kg/日，腹腔注射，4周）及超氧化物歧化酶模擬劑MnTMPyP（5mg/Kg/日，腹腔注射，4周）處理FVB小鼠，并對(duì)部分鼠給予CIH4周，分別從大體標(biāo)本、心功能及分子水平觀察應(yīng)用抗氧化劑后心臟對(duì)CIH的反應(yīng)，以明確氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用。 3MT對(duì)CIH所致心肌損傷保護(hù)作用的研究 為進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用并探討MT作為內(nèi)源性抗氧化劑是否對(duì)CIH所致心肌損傷有保護(hù)作用，我們將8-10周雄性MT-TG鼠及年齡相應(yīng)的野生型FVB鼠同時(shí)暴露于CIH4周及8周，觀察MT-TG鼠心臟對(duì)CIH的反應(yīng)，并通過在MT-TG鼠中觀察到的保護(hù)作用進(jìn)一步反證氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用。觀察及檢測(cè)指標(biāo)同上。 結(jié)果： 1野生型FVB鼠心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng) （1）體重：對(duì)照組體重隨年齡遞增，CIH組體重在處理的相對(duì)早期（3天至3周）及晚期（8周）均明顯低于對(duì)照組，4周時(shí)兩組體重?zé)o顯著差異。 （2）心臟重量及心臟重量與脛骨長(zhǎng)度比值：不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組及CIH組脛骨長(zhǎng)度無顯著差異，CIH組在暴露1周時(shí)心臟絕對(duì)重量及相對(duì)重量均顯著低于對(duì)照組，隨CIH暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，CIH組心臟絕對(duì)重量及相對(duì)重量逐漸增加，至CIH暴露4周時(shí)，明顯高于對(duì)照組，說明CIH暴露4周可誘導(dǎo)心肌肥厚。 （3）ANP及β-MHC的表達(dá)：CIH組3周時(shí)，ANP及β-MHC的mRNA表達(dá)及ANP的蛋白表達(dá)開始增加，與對(duì)照組比較有顯著差異，4周時(shí)，上述指標(biāo)表達(dá)量進(jìn)行性增加，8周時(shí)，CIH組上述指標(biāo)的表達(dá)量仍有增高，但兩組間無顯著性差異，該結(jié)果從分子水平證明了CIH暴露3周開始即可誘導(dǎo)心肌肥厚，4周時(shí)，可誘導(dǎo)包括心臟重量增加在內(nèi)的顯著的心肌肥厚。 （4）心功能改變：CIH組暴露3天至3周時(shí)，心臟結(jié)構(gòu)及功能無顯著改變，4周時(shí)，舒張期及收縮期左室內(nèi)徑（Left ventricle cavitary dimensions, LVID）顯著高于對(duì)照組，左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricle ejection fraction, LVEF）及左室短軸縮短率（Leftventricle fraction shortening, LVFS）明顯降低，8周時(shí)，CIH組舒張期室間隔厚度（Interventricle septem thickness, IVS）、舒張期及收縮期左室后壁厚度（Left ventricleposterior wall thickness, LVPW）明顯低于對(duì)照組，舒張期及收縮期LVID進(jìn)一步增加， LVEF及LVFS進(jìn)行性下降，說明隨著CIH暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，心臟逐漸從肥厚向擴(kuò)張轉(zhuǎn)化，左室收縮功能進(jìn)行性減退。 （5）心肌纖維化：在CIH暴露3天至3周時(shí)，CIH組心肌組織未見明顯膠原沉積，4周及8周時(shí)，CIH組可見心肌組織膠原沉積，且8周明顯重于4周，CTGF及PAI-1的蛋白表達(dá)在4周及8周時(shí)均明顯高于對(duì)照組，說明自CIH暴露4周開始，心肌出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)。 （6）心肌炎癥反應(yīng)：CIH組暴露3天及1周時(shí)，心肌組織VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，4周時(shí)，CIH組VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)明顯上調(diào)，且在心肌組織中可觀察到中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，CIH暴露8周時(shí)心肌炎癥反應(yīng)消失。 （7）心肌細(xì)胞凋亡：在CIH暴露3天至3周時(shí)，未見心肌細(xì)胞凋亡，4周時(shí)，，心肌組織CHOP的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并在心肌組織中發(fā)現(xiàn)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，8周時(shí)，CIH組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞增加，并伴有C-Cas-3的蛋白表達(dá)增加，說明自CIH暴露4周開始出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡。 （8）心肌氧化損傷：CIH組在暴露3天至3周時(shí)，心肌組織MDA含量與對(duì)照組比較無顯著差異，但在CIH暴露4周至8周時(shí)，CIH組MDA的含量顯著高于對(duì)照組，同時(shí)，心肌組織抗氧化指標(biāo)Nrf2及MT的表達(dá)在CIH暴露3天時(shí)顯著高于對(duì)照組，隨著CIH暴露時(shí)間的延長(zhǎng), Nrf2及MT的表達(dá)逐漸下調(diào)，自CIH暴露3周開始，MT的表達(dá)開始下調(diào)，自CIH暴露4周開始，Nrf2的表達(dá)開始下調(diào)，8周時(shí)二者的表達(dá)進(jìn)一步降低，SOD1的表達(dá)在CIH暴露3天至4周時(shí)，兩組無顯著差異，但在CIH暴露8周時(shí)，CIH組SOD1的表達(dá)亦明顯降低，說明氧化損傷是CIH所致心肌損傷的主要發(fā)病機(jī)制，早期心表達(dá)下調(diào)是CIH所致心臟失代償反應(yīng)的主要原因。 2抗氧化劑治療對(duì)CIH誘導(dǎo)的心肌損傷的保護(hù)作用 應(yīng)用抗氧化劑治療后，對(duì)照組及CIH組體重、脛骨長(zhǎng)度、心臟的絕對(duì)重量及相對(duì)重量以及心功能均未見顯著差異，同時(shí)從分子水平對(duì)ANP、CTGF、PAI-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并檢測(cè)了兩組心肌組織MDA的含量，兩組間比較均無顯著性差異。結(jié)果提示，抗氧化劑對(duì)CIH所致心肌損傷有明確的保護(hù)作用，從而進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激在介導(dǎo)CIH所致心肌損傷中的作用。 3MT對(duì)CIH誘導(dǎo)的心肌損傷的保護(hù)作用 將MT-TG鼠暴露于CIH4周及8周發(fā)現(xiàn)，CIH組及對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)均未觀察到體重、脛骨長(zhǎng)度、心臟絕對(duì)重量及相對(duì)重量的變化。同時(shí)，在CIH組及對(duì)照組未觀察到心肌肥厚、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡，心肌炎癥反應(yīng)及氧化損傷指標(biāo)的變化。說明MT對(duì)CIH誘導(dǎo)的心肌損傷有保護(hù)作用，同時(shí)也進(jìn)一步證明在CIH暴露期間，心肌組織MT表達(dá)的變化在CIH誘導(dǎo)的心臟代償及失代償反應(yīng)中的作用以及氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的重要作用。 結(jié)論： 1心臟對(duì)CIH的反應(yīng)存在時(shí)間依賴效應(yīng)，即在CIH暴露早期表現(xiàn)為代償性反應(yīng)，而在CIH暴露的相對(duì)晚期表現(xiàn)為失代償性反應(yīng)。 2氧化損傷是CIH所致心肌損傷的主要發(fā)病機(jī)制，機(jī)體抗氧化能力下降是引起氧化損傷的主要原因，應(yīng)用NOX抑制劑及超氧化物歧化酶模擬劑可以抑制CIH所致心肌損傷。 3心肌組織MT的表達(dá)變化是心臟對(duì)CIH反應(yīng)從代償向失代償轉(zhuǎn)化的主要原因。 4MT作為內(nèi)源性抗氧化劑對(duì)CIH所致心肌損傷有明確的保護(hù)作用。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1動(dòng)態(tài)觀察了心臟對(duì)CIH的反應(yīng)，從細(xì)胞及分子水平系統(tǒng)闡述了心臟對(duì)CIH反應(yīng)的時(shí)間依賴效應(yīng)。 2進(jìn)一步闡明氧化應(yīng)激是CIH誘導(dǎo)心肌損傷的主要機(jī)制，機(jī)體抗氧化能力下降是引起氧化應(yīng)激的主要原因。 3首次證明心肌組織MT表達(dá)的變化在CIH所致的心臟從代償向失代償轉(zhuǎn)化中的作用。 4首次證明MT作為內(nèi)源性抗氧化劑對(duì)CIH所致心肌損傷的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R56;R541

【參考文獻(xiàn)】

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1 張翼,鐘寧,朱海峰,周兆年;間歇性低氧處理大鼠心肌的抗心律失常與抗氧化效應(yīng)[J];生理學(xué)報(bào);2000年02期

2 張翼;楊黃恬;周兆年;;間歇性低氧適應(yīng)的心臟保護(hù)[J];生理學(xué)報(bào);2007年05期

3 王瑩萍;崔芳;張利萍;楊長(zhǎng)瑛;關(guān)s

本文編號(hào)：2247241