發(fā)布時(shí)間：2018-08-22 07:17

【摘要】：研究背景及意義： 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是最常見(jiàn)的慢性呼吸道炎癥性疾病之一,研究顯示,全球哮喘病人約3億多,我國(guó)約有3000萬(wàn),而且仍有不斷增加的趨勢(shì)。盡管通過(guò)全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)推薦的規(guī)范化治療,大部分哮喘病人的臨床癥狀可得到有效控制,但并不能抑制疾病潛在的發(fā)展,因此探討哮喘的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)一步尋找治療靶點(diǎn)具有重要的意義。 氣道上皮細(xì)胞(AEC)作為氣道抵御外來(lái)環(huán)境刺激的第一道防線(xiàn),在維持氣道內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用,在哮喘氣道炎癥的啟動(dòng)和維持中扮演關(guān)鍵角色。雖然支氣管哮喘是以TH-2型炎癥為主的氣道慢性炎癥炎癥性疾病,但其疾病的進(jìn)程及對(duì)外界環(huán)境刺激因素的高度敏感卻不能單純從炎癥的角度來(lái)解釋。有研究表明：哮喘患者存在上皮屏障功能受損,在哮喘患者中氣道上皮細(xì)胞緊密連接及粘附連接蛋白的表達(dá)量較正常人減少,且與嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。氣道上皮結(jié)構(gòu)及屏障功能的破壞,即上皮細(xì)胞間緊密連接等結(jié)構(gòu)蛋白的破壞可導(dǎo)致外界抗原輕易地通過(guò)氣道壁粘膜屏障,與粘膜下DC細(xì)胞等免疫細(xì)胞接觸,從而誘發(fā)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等炎癥因子釋放增加,通過(guò)與粘膜下間質(zhì)細(xì)胞相互作用,可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增生、氣道重塑,從而引起更強(qiáng)更持久的慢性炎癥反應(yīng)。 職業(yè)性哮喘(Occupational Asthma)是工業(yè)化國(guó)家最常見(jiàn)的工作相關(guān)的肺疾病(Work-related lung disease),其發(fā)病比例約占成人哮喘患者的15%。據(jù)統(tǒng)計(jì),異氰酸鹽類(lèi)是引起職業(yè)性哮喘最常見(jiàn)的原因,常見(jiàn)的異氰酸鹽包括甲苯二異氰酸鹽(Toluene Diisocyanate, TDI)、二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、己二異氰酸酯(HDI),其中,由于價(jià)格相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì),TDI的應(yīng)用最為廣泛,主要用于生產(chǎn)軟質(zhì)聚氨酯泡沫及聚氨酯彈性體、涂料、膠黏劑等,在建筑、家居、各種室內(nèi)外裝修中廣泛使用。長(zhǎng)期暴露于TDI環(huán)境的人群,最終約有5%～15%發(fā)展為哮喘,而在普通人群中,哮喘的發(fā)病率約為0.1%～8%,我國(guó)約為0.11%～2.03%。鑒于其高發(fā)病率及所帶來(lái)的巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),TDI所致的職業(yè)性哮喘已引起高度重視,目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及免疫系統(tǒng)相關(guān)和非免疫系統(tǒng)相關(guān)等途徑,暴露人群中的基因易感性可能也參與了TDI哮喘的發(fā)病,但相關(guān)領(lǐng)域的機(jī)制研究還比較局限,許多方面還不清楚,因此進(jìn)一步研究其作用環(huán)節(jié)及尋找新的診斷、治療手段至關(guān)重要。 TDI的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有活性很高的N=C=O基團(tuán),使其成為一種反應(yīng)活性極強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),這一特點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,同時(shí)這種高反應(yīng)性也使其具有較大毒性,也是導(dǎo)致職業(yè)性哮喘的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。TDI作用與人體的重要靶點(diǎn)即氣道上皮細(xì)胞,其與AEC之間的相互作用在TDI哮喘的發(fā)病中具有重要地位。研究表明：氣道上皮單層的屏障結(jié)構(gòu)和其保護(hù)作用可以被異氰酸鹽所損壞,高濃度異氰酸鹽的暴露可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞固縮、DNA碎裂,緊密連接及縫隙連接蛋白解體、電阻改變甚至細(xì)胞的死亡。我們實(shí)驗(yàn)室既往研究也表明：在體外試驗(yàn)中,TDI-HSA復(fù)合物在不影響細(xì)胞活力的情況下,可引起氣道上皮細(xì)胞系(16HBE)細(xì)胞通透性的增加,該通透性的改變與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的釋放有關(guān)。但是TDI對(duì)于氣道緊密連接蛋白、粘附連接蛋白(E-鈣粘蛋白)等的影響并不清楚,在體內(nèi)TDI對(duì)于氣道屏障功能及氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白的破壞作用也有待闡明。 糖皮質(zhì)激素是目前哮喘治療的一線(xiàn)藥物,主要取決于其強(qiáng)大的抗炎作用,糖皮質(zhì)及素可以減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制多種炎癥因子的表達(dá),例如,它可以通過(guò)作用于氣道上皮細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體,抑制氣道上皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子,近期研究亦表明糖皮質(zhì)激素可通過(guò)EGFR受體途徑作用與氣道上皮細(xì)胞,引起正常狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1等重新分布,有增強(qiáng)上皮間屏障功能的作用。但是在損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素是否具有上皮屏障修復(fù)作用尚不清楚。因此探討致敏狀態(tài)或損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素對(duì)氣道上皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用非常重要和必要,這可能為糖皮質(zhì)激素運(yùn)用于哮喘治療提供新的證據(jù),同時(shí)為哮喘的治療找到新的治療靶點(diǎn)。 本研究擬在前期體外實(shí)驗(yàn)證明TDI-HSA可引起氣道上皮通透性增加的基礎(chǔ)上,在體內(nèi)外模型中探討TDI對(duì)氣道上皮E-鈣粘蛋白的表達(dá)和分布變化,進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素在其中的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。 研究方法： 一：動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1、建立穩(wěn)定的TDI誘導(dǎo)的職業(yè)性哮喘小鼠模型。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(溶劑致敏,溶劑激發(fā))、TDI哮喘組(TDI致敏,TDI激發(fā))和地塞米松治療組(TDI致敏,TDI激發(fā),激發(fā)前一天開(kāi)始腹腔注射地塞米松,連續(xù)給藥8天)。觀察各組小鼠的一般狀態(tài),是否出現(xiàn)哮喘癥狀及嚴(yán)重程度程度。 2、利用無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)各組小鼠氣道反應(yīng)性情況：使用不同濃度乙酰甲膽堿(0,3.125,6.25,12.5, and25mg/ml溶解在0.9%生理鹽水中)激發(fā),利用BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)Penh值。 3、耳后淋巴結(jié)的培養(yǎng),血清總IgE的測(cè)定：取小鼠耳后淋巴結(jié),分離出淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng),培養(yǎng)液上清檢測(cè)IL-4、IFN-γ。血清檢測(cè)總IgE水平。 4、小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)：PBS灌洗,灌洗液離心沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù),蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)一步行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。 5、小鼠肺臟組織的病理觀察：取出小鼠肺組織,固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素—伊紅(HE)染色觀察小鼠肺臟病理變化。 6、取小鼠肺臟組織行免疫組化及western blotting檢測(cè),觀察E-cadherin在氣道上皮的表達(dá)及分布情況。 二：細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 1、制備TDI-HSA抗原結(jié)合物：應(yīng)用改良的Son M方法制備TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。應(yīng)用Son et al.'s assay方法測(cè)定復(fù)合物中TDI及HSA結(jié)合比。 2、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度的TDI-HSA及HSA對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o細(xì)胞活力的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加TDI-HSA,只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),TDI-HSA20ug/ml、TDI-HSA40ug/ml、 TDI-HSA60ug/ml、TDI-HSA100ug/ml, HSA20ug/ml、HSA40ug/ml、HSA60ug/ml、HSA100ug/ml按上述分組刺激16HBE24h后,用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。 3、觀察不同濃度TDI-HSA對(duì)16-HBE E-鈣粘蛋白表達(dá)及分布的影響,分組情況：正常對(duì)照組(不加TDI-HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),HSA對(duì)照組(HSA100ug/ml), TDI-HSA40ug/ml組,TDI-HSA60ug/ml組,TDI-HSA100ug/ml組,按上述分組刺激16HBE24小時(shí)后,行免疫熒光檢測(cè)不同濃度TDI-HSA刺激下氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白的分布情況、Western blotting檢測(cè)E-鈣粘蛋白總的表達(dá)水平。 4、觀察地塞米松及ERK通路抑制劑對(duì)TDI-HSA所致的E-鈣粘蛋白破壞是否具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組,HSA對(duì)照組(HSA100ug/ml), TDI-HSA100ug/ml組,地塞米松預(yù)處理組(10-4M或10-6M),ERK通路抑制劑預(yù)處理組(PD9809510-7M),地塞米松單獨(dú)刺激組(10-4M或10-6M)。地塞米松及ERK通路抑制劑均預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)。按上述分組刺激16HBE24小時(shí)后,分別行Western blotting及免疫熒光檢測(cè)E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平及分布情況。 5、觀察TDI-HSA刺激下,16HBE ERK通路的活化情況及地塞米松對(duì)其干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(不加TDI-HSA,只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),HSA100ug/ml組,TDI-HSA100ug/ml組,地塞米松預(yù)處理組(10-6M),按上述刺激分組后,分別于刺激10分鐘及30分鐘時(shí)收取細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)p-ERK及total-ERK水平。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn),以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 一：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果 1、TDI哮喘組小鼠在激發(fā)后可出現(xiàn)呼吸困難的臨床表現(xiàn),地塞米松治療組小鼠的癥狀可部分緩解。隨著乙酰甲膽堿濃度上升,各組小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)指標(biāo)Penh值均出現(xiàn)上升趨勢(shì)。TDI哮喘組小鼠的氣道反應(yīng)性最高。12.5、25mg/ml乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí),TDI哮喘組Penh值與對(duì)照組相比,有顯著差異(P0.001,P0.001)。相對(duì)于TDI哮喘組,12.5及25mg/ml乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí),地塞米松治療組小鼠氣道反應(yīng)性明顯下降(P0.001,P=0.02)。 2、TDI哮喘組小鼠耳后淋巴結(jié)培養(yǎng)液中,IL-4及IFN-y濃度較對(duì)照組明顯增高(P0.001,P0.001)。相對(duì)于TDI哮喘組,地塞米松治療組IL-4及IFN-y濃度顯著降低(P0.001, P=0.001)。TDI哮喘組血清總IgE水平與對(duì)照組相比顯著增高(P0.001)。相對(duì)于TDI哮喘組,地塞米松治療組可顯著降低血總1gE水平(P0.001)。 3、支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)結(jié)果：地塞米松可抑制TDI所致的支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞增加(P=0.031),對(duì)總細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯影響。相對(duì)于正常對(duì)照組組,TDI組小鼠BALF中性粒細(xì)胞比例顯著增加(P=0.017),地塞米松治療組進(jìn)一步顯著增加中性粒細(xì)胞比例(P=0.026)。小鼠肺組織病理可見(jiàn)：TDI組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增高,同時(shí)伴隨氣道上皮細(xì)胞的增殖及部分上皮的脫落。地塞米松可顯著抑制支氣管周?chē)把苤車(chē)难装Y反應(yīng)。 4、免疫組化結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠,E-鈣粘蛋白多連續(xù)分布于氣道上皮細(xì)胞近管腔面,TDI組小鼠氣道上皮細(xì)胞間E-鈣粘蛋白分布顯著減少、排列紊亂、向胞漿內(nèi)彌散較多,在地塞米松治療組,TDI所致的以上改變有部分恢復(fù)。 二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果 1、不同濃度TDI-HSA及不同濃度HSA對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響：TDI-HSA濃度為20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、100ug/ml及HSA濃度為20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、100ug/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)顯著影響(P=0.78)。 2、不同濃度TDI-HSA對(duì)16HBE E-鈣粘蛋白分布及表達(dá)的影響：免疫熒光顯示：在正常16HBE及單獨(dú)HSA處理細(xì)胞,E-鈣粘蛋白多沿胞膜連續(xù)分布于細(xì)胞間連接處,不同濃度TDI-HSA (40ug/ml,60ug/ml,1OOug/ml)處理24小時(shí)后,細(xì)胞間連接處E-鈣粘蛋白的完整性遭到破壞,向胞漿中彌散增多,且以上分布的改變呈濃度依賴(lài)趨勢(shì)。Western blotting檢測(cè)E-鈣粘蛋白總的表達(dá)水平,在各組間無(wú)顯著差異(P=0.99)。 3、地塞米松及ERK通路抑制劑對(duì)TDI-HSA所致E-鈣粘蛋白破壞的影響：相對(duì)于TDI-HSA處理組,地塞米松(10-4M,預(yù)處理1小時(shí))預(yù)處理組及ERK抑制劑(PD9809510-7M預(yù)處理1小時(shí))預(yù)處理組,E-鈣粘蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變可部分被逆轉(zhuǎn)。Western blotting所見(jiàn),各組E-鈣粘蛋白總表達(dá)量無(wú)明顯改變(P=0.79)。 4、TDI-HSA對(duì)ERK通路活化水平的影響及地塞米松對(duì)其干預(yù)作用：TDI-HSA100ug/ml刺激16HBE10分鐘及30分鐘,western blotting可見(jiàn)p-ERK水平顯著增加(P0.001,P=0.03),尤其以10分鐘時(shí)作用最顯著。地塞米松預(yù)處理組(10-6M,預(yù)處理1小時(shí))可顯著抑制TDI-HSA所誘導(dǎo)的p-ERK水平(刺激10分鐘時(shí)P=0.034,刺激30分鐘時(shí)P=0.025)。 結(jié)論： 1、在TDI哮喘小鼠模型及16HBE細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證明,TDI可顯著誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白分布的改變。但對(duì)E-鈣粘蛋白總的表達(dá)量無(wú)顯著影響。 2、TDI在動(dòng)物模型及細(xì)胞水平均可誘導(dǎo)氣道上皮ERK通路的活化。體外ERK通路抑制劑(PD98095)可顯著抑制TDI所致的氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白分布的改變。 3、地塞米松可通過(guò)抑制ERK活化水平,減弱TDI所致的E-鈣粘蛋白分布的改變。 4、地塞米松治療可減輕TDI哮喘小鼠的呼吸困難的臨床癥狀、氣道高反應(yīng)性、支氣管血管周?chē)难装Y浸潤(rùn)及上皮細(xì)胞脫落,可減少肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的比例,但卻使中性粒細(xì)胞比例進(jìn)一步增加。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 莫冠文;蔡紹曦;趙海金;李文軍;佟萬(wàn)成;劉來(lái)昱;;甲苯二異氰酸鹽對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞通透性的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年02期

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本文編號(hào)：2196363