本文選題：Cd300lf + 腺病毒載體　； 參考：《浙江大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：過敏性哮喘是以氣道高反應(yīng)性(airway hypersensitivity, AHR).嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞過度浸潤以及血清高水平IgE為特征的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。目前研究認(rèn)為,T淋巴細(xì)胞優(yōu)勢性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2類細(xì)胞因子在過敏性哮喘的引發(fā)中扮演著重要角色。Cd3001f(CD300 antigen like family member F)分子是一個氨基端帶有信號肽、胞外段帶有IgV樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、胞內(nèi)段帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(immune-receptor tyrosine-based inhibitory motifs, ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序(immune-receptor tyrosine-based switching motif, ITSM)的Ⅰ型糖蛋白。有研究顯示,阻斷或沉默樹突狀細(xì)胞表面Cd3001f分子的表達(dá)能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞啟動的T細(xì)胞增殖以及抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答,表明Cd3001f分子具有負(fù)向調(diào)控樹突狀細(xì)胞啟動T細(xì)胞應(yīng)答的功能。在本研究中,我們根據(jù)GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM 145634.3),設(shè)計含完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)的Cd3001f基因特異性引物,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)從小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)中擴(kuò)增得到Cd3001f基因,將其與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Cd3001fo經(jīng)生物信息學(xué)分后,設(shè)計特異性引物以重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f.為模板聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增Cd3001f基因編碼區(qū)不含信號肽的胞外段,將其與pGEX-4T-3載體連接構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Cd3001f (22 aa-185aa).原核表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (E3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約45.5kD的GST-Cd3001f (22aa-185aa)融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GSTrap FF親和層析柱純化后皮下免疫接種新西蘭大白兔,制備了抗GST-Cd3001f (22 aa-185aa)融合蛋白多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)結(jié)果顯示,其抗體效價高達(dá)1：16384。將Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney 293 cells, HEK293),間接免疫熒光實驗(indirect immunofluorescence assays, UFA)和免疫印跡實驗(Western blot)檢測兔抗GST-Cd3001f (22-185aa)融合蛋白多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示,該多克隆抗體能夠特異性的識別Cd3001f真核表達(dá)蛋白。根據(jù)siRNA設(shè)計原則,設(shè)計5對小鼠Cd3001f基因保守序列編碼短發(fā)卡KNA (short hairpin RNA, shRNA)的正義、反義寡核苷酸鏈,將其退火后分別克隆至pLL3.7質(zhì)粒載體中獲得Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法,分別將Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA-Cd3001f共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時。Real-time PCR分析顯示,重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe對Cd3001f基因mRNA抑制率為75.6%。以重組質(zhì)粒pMD18-Cd3001f為模板PCR擴(kuò)增Cd3001f基因,將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中。以重組質(zhì)粒PLL-Cd3001f-shRNAe為模板PCR擴(kuò)增含U6啟動子的Cd3001f基因shRNA,將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack中。Pme I酶切陽性重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化含重組腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy-1的感受態(tài)菌BJ5183,進(jìn)行同源重組。PacⅠ酶切重組腺病毒載體后,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12-18天,獲得重組腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量擴(kuò)增重組腺病毒,并采用CsCl密度梯度離心法進(jìn)行純化。重組腺病毒Ad-Cd3001f滴度為1.4×109PFU/ml, Ad-Cd3001f-shRNA滴度為2.6×109PFU/mL以感染復(fù)數(shù)(a multiplicity of infection, MOI)為75的重組腺病毒感染BMDCs48小時。Real-time PCR分析顯示,Ad-Cd3001f感染細(xì)胞中Cd3001f基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高,而Ad-Cd3001f-shRNA感染細(xì)胞中Cd3001f基因nRNA表達(dá)水平下降達(dá)51.7%。Westernblot分析顯示,Ad-Cd3001f感染細(xì)胞特異性地表達(dá)了Cd3001f蛋白。分別于第0天、第14天給C57BL/6小鼠腹腔注射經(jīng)凝膠佐劑乳化的卵清白蛋白(ovalbumin, OVA),第二次致敏后10天OVA溶液連續(xù)激發(fā)3天。以MOI為75的重組腺病毒Ad-Cd3001f (DC-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA (DC-siCd3001f)分別感染培養(yǎng)5天的BMDCs24小時,再用OVA激發(fā)24小時。分別于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激發(fā)后24小時,檢測氣道高反應(yīng)性。吉姆薩瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性細(xì)胞分類計數(shù)。HE和PAS染色觀察肺組織病理學(xué)變化。EL1SA檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF).脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-y的含量。流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+ Tregs和CD4+IL-17A+ Th17的百分比。研究結(jié)果顯示,DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能夠減輕氣道高反應(yīng)性和肺組織炎癥,降低肺泡灌洗液和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌,提高脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比,降低脾細(xì)胞中CD4+IL-17A+Th17的百分比。綜上所述,過繼性回輸DC-siCd3001f能夠顯著降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性,抑制氣道炎癥,減少Th2類細(xì)胞因子的分泌以及引發(fā)脾臟中高比例的CD4+FoxP3+ Tregs和低比例的CD4+IL-17A+Th17,為哮喘的治療提供了新思路。
[Abstract]:Allergic asthma is airway hyperresponsiveness ( AHR ) . 鍡滈吀鎬х矑緇嗚優(yōu)鍜孴h2緇嗚優(yōu)榪囧害嫻告鼎浠ュ強(qiáng)琛，

本文編號：1985681